EnglishisÍslenska

Member institutions

Search in


ThesisUniversity of Iceland>Heilbrigðisvísindasvið>Meistaraprófsritgerðir>

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1946/12087

Titles
  • Lentiviral host restriction and viral countermeasures: The vif gene of maedi-visna virus

  • is

    Lentiveiruhindrun og varnir veira gegn hindrun: Vif gen mæði-visnuveiru

Published
May 2012
Abstracts
  • is

    Mæði-visnuveira (MVV) er lentiveira af flokki retróveira (Retroviridae). Veiran sýkir kindur og veldur lungnabólgu (mæði) og heilabólgu (visnu). Dæmi um aðrar lentiveirur eru eyðniveirurnar í mönnum (HIV-1 og HIV-2) og köttum (FIV), smitandi liða- og heilabólga í geitum (CAEV) og smitandi blóðleysi í hestum (EIAV).
    Á síðustu árum hefur komið sífellt betur í ljós að stöðugt vopnakapphlaup er á milli lífvera og veira. Lífverur hafa komið sér upp ýmis konar vörnum gegn veirum og veirur hafa svarað með þróun fjölbreyttra aðferða til að komast fram hjá vörnum hýsilfrumna sinna.
    Lentiveirur hafa próteinið Vif (virion infectivity factor) sem hefur það velþekkta hlutverk að leiða til niðurbrots APOBEC3 (A3) próteina hýsilfrumna, en þau eru cytósín afamínasar sem valda miklum fjölda G-A stökkbreytinga í +DNA veirunnar ef Vif prótein er ekki virkt. HIV-1 Vif binst við Cullin 5 (Cul5) sem er hýsilprótein og kallar að önnur prótein sem tilheyra Cul5 E3 úbíkítín lígasaflóka. Þessi flóki fjölúbíkínierar A3 prótein sem leiðir til þess að þau eru brotin niður í próteasómi frumunnar. MVV bindur Cullin 2 (Cul2) vel en Cul5 verr, auk þess að vera ekki með varðveitt Cul5 set.
    Við fundum hugsanlegt Cul2 bindiset í MVV Vif og gerðum stökkbreytingar á því bæði í klónaðri veiru og einnig í táknabestuðu vif plasmíði til tjáningar í spendýrafrumum í eins hrings sýkingarkerfi með kinda A3.
    Niðurstöður leiddu í ljós að veira með stökkbreytinguna vex hægar og verr en villigerð veiru. Þegar niðurbrot á A3 var skoðað kom í ljós að A3 var aðeins brotið niður að hluta til með Vif sem hafði stökkbreytingar í þessu hugsanlega Cul2 seti.
    Þetta bendir til að ætlaða Cul2 setið sé ekki notað einvörðungu, og ef til vill sé Cul5 notað til að mynda E3 ubikítín lígasaflóka þegar Cul2 binding er eyðilögð. Niðurstöðurnar benda til þess að Vif prótein lentiveira hafi að nokkru leyti þróast óháð til að nota mismunandi leiðir við niðurbrot A3 próteina.
    Niðurstöður úr rannsóknum á Keldum benda til þess að Vif próteinið í MVV gegni fleiri hlutverkum en að hindra A3.
    CA-Vif veira er mæði-visnuveira með tvær stökkbreytingar, L120R í hylkispróteini (CA) og P205S í Vif sem valda því að veiran vex illa í fósturliðþelsfrumum (FOS) og átfrumum. Veiran vex hinsvegar ágætlega í kindaæðaflækjufrumum (SCP). Ef veirur með aðra hvora stökkbreytinguna en ekki báðar voru ræktaðar í FOS eða átfrumum kom þessi svipgerð ekki fram. Þetta bendir til þess að einhver tengsl séu á milli hylkis og Vif próteins.
    Til að kanna hvort þessi hindrun á veirufjölgun í FOS frumum væri í víxlritun, voru gerðar sýkingartilraunir með CA-Vif veirur með uppruna úr annað hvort kindaæðaflækjufrumum eða FOS frumum og sýni tekin á fyrstu klukkustundunum eftir sýkingu. Niðurstöður sýndu að aðalmunur á CA-Vif og villigerð af MVV kom fram eftir 24 tíma sýkingu , þ.e.a.s. eftir að víxlritun er lokið. Þetta bendir til þess að hindrun verði ekki við víxlritastig veirunar, en gæti einnig bent til að í FOS frumum væri hindri sem hefur áhrif á hylkið á einhverju stigi eftir víxlritun, og að Vif verji veiruna fyrir þessum hindra.

  • Maedi-visna virus (MVV) belongs to the lentivirus subgroup of retroviruses (Retroviridae). MVV infects sheep and causes slowly progressive pneumonia (maedi) and encephalomyelitis (visna). Examples of other lentiviruses are the immunodeficiency viruses of humans (HIV-1 and HIV-2) and cats (FIV), caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) and equine infectious anemia virus (EIAV).
    Recently a constant arms race between host organisms and viruses has become apparent. Organisms have evolved a variety of mechanisms to fight viral infections while the viruses have developed means of counteracting those defenses in various ways.
    Lentiviruses have the protein Vif (virion infectivity factor) whose well known role is to lead to degradation of the host cell APOBEC3 (A3) proteins, but they are cytosine deaminases that deaminate cyrosine in the viral –DNA strand, thus causing G-A hypermutations in the viral +strand DNA if the Vif protein is defective or missing. HIV-1 Vif binds to Cullin 5 (Cul5), a host protein, and recruits other host proteins to form a Cul5 E3 ubiquitin ligase complex. This complex polyubiquitinates A3 proteins, leading to their degradation by the cellular proteasome. MVV Vif binds Cullin 2 (Cul2) more strongly than Cul5, and does not have a conserved Cul5 binding site.
    We found a putative Cul2 binding site in MVV Vif and mutated it both in a molecularly cloned virus and in a vif plasmid codonoptimized for expression in mammalian cells. The cloned Vif was tested in single-cycle infectivity assays with ovine A3.
    The results show that a virus with mutations grows slower than a wild type MVV. When A3 degradation was analyzed we saw that A3 is only partially degraded if Vif has the mutation in the putative Cul2 binding site.
    This indicates that the putative Cul2 site is not used solely, and possibly Cul5 is used to form an E3 ubiquitin ligase complex when Cul2 binding is disrupted. The results indicate that the lentiviral Vif proteins have evolved diverse ways to degrade A3 proteins.
    Results from research done at Keldur implies that the MVV Vif protein has other roles than counteracting A3.
    CA-Vif virus has two mutations, L120R in CA and P205S in Vif that cause the virus to replicate poorly in fetal ovine synovial (FOS) cells and macrophages while replication in sheep choroid plexus (SCP) cells is not inhibited. This phenotype is not seen in a virus with either mutation alone. This implies that some connection exists between capsid and the Vif protein of MVV.
    To test whether the CA-Vif mutant had a block before or after reverse transcription, CA-Vif virus obtained from either SCP or FOS cells was compared to a wild type virus in FOS or SPC cells for the first hours after infection. The results show that the main difference between CA-Vif and the wild type virus was seen after 24 hour infection, i.e. after reverse transcription is completed. This implies that the block is not at the reverse transcription stage, but could also imply that FOS cells have a host restriction factor that affects the capsid at some stage after reverse transcription and that Vif protects the virus from this restriction factor.

Issued Date
09/06/2012


Artifacts
Name[Asc]Size[Sortable]Visibility[Sortable]Description[Sortable]Format
MS ritgerð Harpa L... .pdf4.6MBOpen Complete Text PDF View/Open