is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár)

Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/18551

Titill: 
  • Titill er á ensku Generation of stable cell lines with doxycycline inducible MITF expression
  • Myndun stöðugra frumulína með doxycyline háðri MITF tjáningu
Námsstig: 
  • Bakkalár
Útdráttur: 
  • Microphthalmia associated transcription factor (MITF) er lykilprótein í þroskun litfrumna (melanocytes) og er talið vera æxlisvaldandi þáttur í sortuæxlum. Verkefni þetta fólst í því að smíða piggyBac genaferjur sem tjá þrjú afbrigði af MITF og útbúa stöðugar HEK293 frumurlínur sem tjá MITF undir stjórn Tet-On kerfisins. MITF afbrigðin voru MITFwildtype (MITF-m isoformið, 419aa), MITFspotted sem skortir 18 bp röð vegna splæsingar og MITFspotless sem auk þess að vanta 18 bp röðina ber stökkbreytinguna K316Stop. Þetta síðasta afbrigði var fundið sem stökkbreyting sem bælir svipgerð annarra stökkbreytinga í Mitf og ekki hefur enn tekist að útskýra hvernig breytingin veldur bæliáhrifum. Virkni kerfisins var sannreynd með vesturþrykksgreiningu (Western Blot) fyrir og eftir örvun með doxycycline. Með myndun þessa kerfis hefur verið útbúið öflugt tæki til samanburðarrannsókna á virkni þessara MITF afbrigða í spendýrafrumum en þannig má fá innsýn í virkni MITF próteinsins. Hér eru fyrstu skrefin í þessum samanburði tekin og samanburður gerður á stöðugleika MITF afbrigðanna eftir cycloheximide meðferð. Einnig var fosfórun serín 73 amínósýrunnar hjá MITF skoðuð. Niðurstöðurnar benda til hærri stöðugleika MITFspotted afbrigðisins borið saman við villigerðar og spotless afbrigðin. Einnig kemur í ljós að MITFspottless er fosfórýlerað á serín 73 seti, þrátt fyrir að serín 409 sé ekki til staðar.

  • Útdráttur er á ensku

    Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) is a key protein in the development of melanocytes and an oncogene in a subset of human melanomas. In this project three variants of the Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) protein were cloned into a piggyBac vector to set up stably transfected HEK293 cell lines with doxycycline inducible MITF expression using the Tet-On system. The variants were MITFwildtype containing mouse MITF-m (419aa), MITFspotted which is a mutant of MITF lacking the alternatively spliced exon 6A and MITFspotless an intragenic suppressor mutation of MITFspotted that in addition to MITFspotted contains a premature stop codon (K316Stop). An explanation for this suppressor behavior, at the molecular level has yet to be solved. The vectors were constructed and verified and stable cells generated with transfection. The function of the system was demonstrated with Western Blotting, by comparing MITF expression in stably transfected cells with and without doxycycline. By generating these cell systems a powerful tool has been produced to do comparative analysis of the different function of the MITF variants in mammalian cells. This can hopefully be used to gain insight into the function of MITF. Here, the first steps of these comparative analysis are done; comparing the stability of the MITFs variants after cycloheximide treatment of cells and comparison of the phosphorylation state of MITF. The results indicate a higher stability of MITFspotted compared to its counterparts. Unexpectedly serine 73 phosphorylation still takes place in MITFspotless, despite lacking the required serine 409 phosphorylation.

Samþykkt: 
  • 30.5.2014
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/18551


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Kristján BS verkefni.pdf812.31 kBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna