Pre-validation of UPLC-QqQ-MS/MS Procedure for Quantification of 2,8-Dihydroxyadenine in Human Urine

Abstract

APRT deficiency is caused by mutations in the APRT gene leading to little or no activity of APRT enzyme. Adenine is then converted to 2,8-dihydroxyadenine via xanthin oxidase with 8-hydroxyadenine as intermetiate. 2,8-dihydroxyadenine is very insoluble in human urine and causes nephrotoxicity, renal stones and if not treated it can lead to chronic kidney disease and even kidney failure. Early diagnosis is the key to handling the deficiency. PCR amplification can be used to identify mutations within the APRT gene. Light microscope is used to diagnose the deficiency followed by APRT enzyme activity test. HPLC, X-ray crystallography have been used to diagnose it as well as HPLC-QqQ-MS/MS. The aims of this study was to pre-validate UPLC-QqQ-MS/MS procedure for quantification of 2,8-dihydroxyadenine in human urine and to develop sample preparation method.The results for the development of the sample preparation method show that dilution 1:15 (v:v) with 10 mM NH4OH was the optimal sample preparation for 2,8-dihydroxyadenine in human urine.Pre-validation of UPLC-QqQ-MS/MS procedure for quantification of 2,8-dihydroxyadenine in human urine was performed. Lower limit of quantification (LLOQ) were confirmed to be 100 ng/mL. The calibration curve for DHA was performed over concentration range from 100 ng/mL to 5000 ng/mL with R2 >0.99. Accuracy and precision were within acceptable criteria for almost all different urine matrixes tested. Matrix effect, carry over and over the curve were also tested. Auto-sampler stability was verified for at least 18 hours. The results show that it is very important to perform pre-validation prior to full validation since different source of matrixes can influence the final results.

APRT skortur orsakast af stökkbreytingum í APRT geni sem leiðir til lítillar eða engrar virkni APRT ensímsins. Adeníni er þá umbreytt í 2,8-díhýdroxíadenín (DHA) með xanthín oxidasa (XO) með 8-hýdroxýadenine sem milli efni. DHA er mjög torrleyst efni í þvagi og getur valdið nýrnaskemmdum, nýrnasteinum og jafnvel krónískum nýrnasjúkdóm og nýrnabilun sé skorturinn ekki meðhöndlaður. Snemmbær greining er lykillinn að meðhöndlun sjúkdómsins. PCR mögnun er notuð til að bera kennsl á stökkbreytingar í APRT geninu. Ljós-smásjár er notaður til að greina sjúkdóminn en einnig þarf APRT ensímvirkni próf með greiningunni. HPLC, röntgenkristallafræði og HPLC-QqQ-MS/MS hafa verið notaðar til greiningar á sjúkdómnum. Markmið þessa rannsóknaverkefnis var að for-gilda UPLCC-QqQ-MS/MS magngreiningaraðferð fyrir 2,8-díhýdroxíadenín í þvagi og þróa sýnameðhöndlunaraðferð.Niðurstöður sýnameðhöndlunaraðferðar þróunar sýndu að þynning 1:15 (v:v) með 10 mM NH4OH er ákjósanlegasta aðferðin fyrir DHA í þvagi.For-gilding UPLCC-QqQ-MS/MS magngreiningaraðferð fyrir 2,8-díhýdroxíadenín í þvagi var framkvæmd. Lægsti mælanlegi styrkur (LLOQ) var staðfestur sem 100 ng/mL. Staðalkúrfa fyrir styrk DHA var á bilinu 100 ng/mL til 5000 ng/mL með R2 >0,99. Áreiðanleiki og nákvæmni var innan leyfilegra marka fyrir flest mismunandi þvagsýni. Matrixu áhrif, smit milli innskota og hár styrkur þynntur niður á staðalkúrfu voru skoðuð. Stöðugleiki í sýna-hólfi var staðfestur fyrir að minnsta kosti 18 klst. Niðurstöður sýna að það er mjög mikilvægt að framkvæma for-gildingu fyrir fulla valideringu þar sem matrixur úr mismunandi einstaklingum geta haft áhrif á endanlegar niðurstöður.