is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár)

Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/24715

Titill: 
  • Titill er á ensku The effects of amino acid substitutions near the N-terminus on thermal adaptation of VPR, a subtilisin-like serine proteinase from a psychrotrophic Vibrio-species
Námsstig: 
  • Bakkalár
Útdráttur: 
  • Útdráttur er á ensku

    The research project is based upon previous studies that have been done at the lab of the instructor and their aim was to study the structural properties involved in temperature adaptation of a subtilisin-like serine protease VPR, from a psychrophilic Vibrio species. In order to increase the thermal stability of the enzyme, mutations were selected on the basis of comparisons to a homologous thermophilic enzyme, aqualysin I, from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. For this study, a truncated form of VPR was used (VPR∆C) with a shortened C-terminus. Two different mutations were done on the VPR∆C gene, a previously studied VPR∆C_N3P/I5P which resulted in increased thermal stability of the protease, but which also decreased its catalytic efficiency significantly. The second variant, VPR∆C_W6Y led to a decrease in thermal stability with no significant change in kcat. Both substitutions are located at the N-terminus and also close to a calcium binding site (Ca3) which is also present in AQUI.
    The hypothesis is that these substitutions may affect the Ca3 binding site and cause a change in the thermal adaptation of the enzyme. To test this hypothesis we theorized that VPR∆C_N3P/I5P should have a higher optimal temperature (Topt) than VPR∆C due to its increased stability against thermal denaturation. VPR∆C_W6Y has shown a significant decrease in its stability against thermal denaturation (T50%) and we estimated that it would shift its Topt towards colder temperatures than that of VPR∆C due to the placement of the altered residue and that its lower stability against thermal denaturation is due to lowered affinity for Ca2+-binding.
    The results of optimal temperature assays showed no significant change in Topt for VPR∆C_N3P/I5P, the change was within 1 °C and can be estimated as operator error. VPR∆C_W6Y, however, showed a decrease of 7-8 °C in optimal temperature and supported the hypothesis that the mutation had shifted the temperature optimum of the enzyme. To study the effects of the mutation further T50% assays were performed on VPR∆C_W6Y and VPR∆C for comparison. The enzymes were assayed against 0 – 30 mM concentrations of CaCl2 to determine the effects of calcium concentrations on their stability. Results showed that VPR∆c_W6Y may have less affinity for Ca2+ ions than VPR∆C , the strongest evidence for this is seen in the 0 – 1 mM concentration comparison for VPR∆C and VPR∆c_W6Y where VPR∆C showed an increase in stability between those two data points, whereas VPR∆_W6Y did not. It is most likely a result of lowered affinity for Ca2+ whereas the enzyme is not able to compete for calcium ions with 1mM EDTA at 0 and 1 mM concentrations of CaCl2. The stability of both enzymes was increased with increased CaCl2 concentrations but there was a significant difference in thermal stability between VPR∆C and VPR∆C_W6Y, where VPR∆C_W6Y was much more sensitive to thermal denaturation than VPR∆C.

  • Rannsóknaverkefnið er byggt á fyrri rannsóknum sem unnar hafa verið á rannsóknarstofu leiðbeinanda og snúa þær að því að útskýra forsendur hitastigsaðlögunar og þá byggingalegu þætti sem stuðla að auknum hitastöðugleika í subtilisin-líkum serín próteinasa VPR, úr kuldakærri Vibrio tegund. Til þess að reyna að auka hitastöðugleika ensímsins voru gerðar samanburðarrannsóknir við ensímið aqualysin I (AQUI) úr hitakæru örverunni Thermus aquaticus sem hefur samsvarandi þrívíddarbyggingu og valdar út mögulegar stökkbreytingar fyrir VPR með AQUI sem módel til þess að auka hitastöðugleika VPR. Notað var C-enda stytta afbrigðið af VPR (VPR∆C) við rannsóknina og tvær stökkbreytingar, önnur sem hefur áður verið gerð VPR∆C_N3P/I5P, sem olli mikilli aukningu í stöðugleika gegn hitaafmyndun, en einnig miklu tapi í virkni. Hitt stökkbrigðið sem rannsakað var er VPR∆C_W6Y. Sú stökkbreyting hafði áður verið rannsökuð og sýnt að hún olli minnkun í hitastöðugleika án þess að hafa mikil áhrif á virkni. Stökkbreytingarnar eru báðar nálægt N-enda próteinsins og þar er mikilvægt Ca2+ bindiset (Ca3) sem einnig er til staðar í AQUI. Tilgátan var sú að stökkbreytingarnar kunni að hafa áhrif á þetta bindiset og ætti VPR∆C_N3P/I5P að hafa hærra kjörhitastig vegna aukins stöðugleika gagnvart hitafmyndun og gæti það verið merki um sterkari bindingu við Ca2+ jónir í þessu bindiseti en hjá VPR∆C_W6Y, þar sem mikil lækkun var í stöðugleika og er tilgátan að kjörhitastig ætti að vera lægra fyrir þetta ensím og ætti það einnig að vera viðkvæmara fyrir hitaafmyndun vegna minnkaðrar bindisækni Ca3 bindisetsins.
    Til að kanna áhrif þessara stökkbreytinga á hitastigsaðlögun ensímsins voru framkvæmdar mælingar á kjörhitastigi (Topt) VPR∆C, VPR∆C_N3P/I5P og VPR∆C_W6Y. Niðurstöður þeirra mælinga leiddu í ljós smávægilega lækkun í hitastigsaðlögun fyrir VPR∆C_N3P/I5P sem er þó vart marktæk þar sem kjörhitastigsferlar VPR∆C og VPR∆C_N3P/I5P voru nánast óaðgreinanlegir og lækkunin var innan við 1 °C. Hins vegar var skýr breyting í VPR∆C_W6Y þar sem kjörhitastig lækkaði um 7-8 °C. Til að skýra það betur voru gerðar hitaafmyndunar- tilraunir (T50%) á VPR∆C_W6Y og VPR∆C og borinn saman hitastöðugleiki þeirra yfir bilið 0 – 30 mM af CaCl2 til að rannsaka stöðugleika ensímanna gagnvart CaCl2 styrk.
    Niðurstöður leiddu í ljós að VPR∆_W6Y hefur minni bindisækni í Ca2+ jónir heldur en VPR∆C, við 1mM EDTA við 0 og 1 mM styrk af CaCl2 er lítil sem engin stöðugleika aukning í stökkbrigðinu í samanburði við VPR∆C. Hitastöðugleiki beggja ensímanna byggist á Ca2+ styrk í lausninni en gífurlega mikill munur er á milli VPR∆C og VPR∆C_W6Y, þar sem stökkbrigðið er mjög óstöðugt gagnvart hitaafmyndun.

Samþykkt: 
  • 25.5.2016
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/24715


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
The_effects_of_aa_subst..pdf1.36 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna
CCF25052016.pdf622.26 kBLokaðurYfirlýsingPDF