Sannprófun miR-199a marksets á ets2 3’UTR í bleikju

Abstract

Bleikjustofnar Þingvallavatns hafa verið mikið rannsakaðir sökum aðgreiningar þeirra m.t.t. lögunar, vistfræði og hegðunarmynstra þeirra. Fjórir stofnar eru í vatninu; tveir botnlægir stofnar, einn svifætu stofn og sá fjórði er fiskæta. Botnlægu fiskarnir hafa styttri trjónu og styttri neðri kjálka meðan hinir tveir stofnarnir hafa lengri trjónu og neðri kjálka að svipaðri lengd og sá efri. Í tilraunum með víxlæxlun og stjórn á umhverfi fiskanna, hefur verið sýnt fram á að erfðir spila hlutverk í hvortveggja mismun á lögun fiskssins og hegðun hans m.t.t. fæðuöflunar. Tjáningarmynstur miRNA er mismunandi milli stofna og lagt hefur verið til að það sé drifkraftur í kvíslun stofna. Vitað er að eitt þessara miRNA er miR-199a sem m.a. hefur áhrif á beinmyndun. Rannsókn á genatjáningu var framkvæmd með hliðsjón af höfuðkúpu myndun (Ahi et al. 2014) sem greindi frá Ets2, ásamt öðrum eftirmyndunarþáttum, sem mögulegum stýrlum þessa gena kerfis. ets2 sýndi einnig öfuga tjáningu við miR-199a og mögulegt tengi set á 3’UTR röð sinni fyrir miR-199a bindingu. Til þessa að meta hvort að miR-199a hefur tengi set á ets2 og hvort að þau eigi samskipti innan frumunnar klónaði ég ets2 3’UTR röðina inn í lúsiferasa klöguskjóðu genaferju. Þar að auki hannaði ég neikvæð viðmið með því að framkalla QuikChange stökkbreytingu og hóf að undirbua lúsiferasa próf.

The Arctic charr morphs in Lake Thingvallavatn, Iceland, have been subject to much research due to their distinct morphological, ecological and behavioural differences. Four morphs reside in the lake; two benthivorous morphs, a planktivorous morph and a piscivorous morph. The benthivorous morphs have a short snout and shorter lower jaw while the other two morphs have longer snouts and lower jaws close in length to the upper jaw. Through experiments with crossbreeding and controlling of the environment of the fish, it has been shown that genetics play a role in both the differences in morphology and in feeding behaviour. miRNA expression patterns in particular, differ between the morphs and this has been suggested to be a potential driving force in the divergence of morphs. One of these miRNAs is miR-199a, a known regulator of skeletogenesis. A gene expression study focusing on craniofacial development (Ahi et al. 2014) identified Ets2, among other transcription factors, as a potential regulator of the gene network. ets2 also showed opposite expression patterns to miR-199a and a predicted target site on its 3’UTR for miR-199a coupling. To determine whether miR-199a has a target site on ets2 and whether they associate in the cell I cloned ets2 3’UTR sequence into a luciferase reporter gene vector. Additionally, I created negative controls using QuikChange mutagenesis and set out to conduct a luciferase assay.