EnglishisÍslenska

Member institutions

Search in


ThesisUniversity of Iceland>Verkfræði- og náttúruvísindasvið>Meistaraprófsritgerðir>

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1946/6449

Title
is

Áhrif lykkjusvæða á kuldaaðlögun alkalísks fosfatasa úr Vibrio örveru

Published
October 2010
Abstracts
  • is

    Lífverur finnast á mjög harðbýlum svæðum jarðar, svo sem við mjög há eða lág hitastig, háa seltu sjávar, eða öfgafull sýrustig. Mörg prótein þurfa að aðlagast slíkum aðstæðum með breytingum í innri gerð. Samanburður á því sem breyst hefur í amínósýruröð með skyldum próteinum gefur upplýsingar um þætti sem ráða mestu um virkni þeirra. Kuldakær ensím hafa oftast meiri sveigjanleika innan heildarbyggingar sinnar miðað við hitaþolin ensím, sem kemur í veg fyrir að nauðsynlegar hreyfingar frjósi. Nokkrir þættir stuðla að auknum sveigjanleika þeirra. Sem dæmi hafa kuldaaðlöguð ensím gjarnan færri vetnistengi, færri saltbrýr, og fleiri yfirborðshleðslur. Kuldakær ensím hafa einnig oft stærri yfirborðslykkjur samanborið við samsvarandi ensím úr miðlungs- og hitakærum lífverum.
    Í þessu verkefni var sjónum beint að hlutverki yfirborðslykkju við mótun séreiginleika sem fundist hafa í alkalískum fosfatasa úr Vibrio sjávarörveru. Gerðar voru staðbundnar breytingar í amínósýruröð lykkjunnar til að skoða betur áhrif hennar á stöðugleika og virkni ensímsins. Fimm punktbreytingar voru framkvæmdar ásamt einni lykkjustyttingu. Við þessar stökkbreytingar voru vetnistengi sem lykkjan myndar við kjarna næstu undireiningu ýmist rofin eða vetnistengjum bætt við (F335Y). Tvö stökkbrigði (F355Y og Y346F) sýndu svipaða virkni og stöðugleika samanborið við villigerð. Hin stökkbrigðin þrjú (R336L, S79A og S79A/S87G) ásamt lykkjuúrfellingunni (Δ337-341;Ser-Gly-Glu-Ala-Phe) reyndust óstöðugari. Rofin vetnistengi af völdum stökkbreytinganna eru líkleg ástæða fyrir hækkun í kcat, lækkaðs T50% gildis og lækkunnar bræðslumarks (Tm). Allt að 6-7°C lækkun í Tm mældist fyrir stökkbrigðin samanborið við villigerð. Lykkjan og vetnistengin sem hún myndar við næstu undireiningu eru því greinilega mikilvæg fyrir stöðugleika og virkni ensímsins. Kvikar hreyfingar ensímsins voru einnig kannaðar með tölvureikningum.

  • Organisms can be found in the harshest environments on Earth, such as at very high or low temperatures, at high salinity, or extreme acidity. Proteins of these organisms have adapted to these environments by changes in amino acid composition. Psychrophilic enzymes are found to have greater overall flexibility compared with thermophilic proteins, as flexibility is an important factor in allowing necessary dynamic movement at low temperatures. Several factors contribute to their greater flexibility. As an example, cold adapted enzymes typically have fewer hydrogen bonds, fewer salt bridges, and more surface charges. Psychrophilic enzymes also tend to have larger surface loops compared with their homologous enzymes from thermostable organisms.
    This project focuses on the role of a large surface loop on the activity and stability of alkaline phosphatase from a cold adapted Vibrio marine bacterium. Site directed mutagenesis was carried out on the large surface loop. Five point mutations were made and one loop deletion. These mutations were chosen to understand the role of hydrogen bonding from the loop to the next monomer. Hydrogen bonds were either added (F335Y) to this area or deleted. Two mutants (F355Y and Y346F) showed similar activity and stability compared with wild type. The three other point mutations (R336L, S79A and S79A/S87G) and the loop deletion (Δ337-341;Ser-Gly-Glu-Ala-Phe) were found to cause lower stablility than that of wild type. The putative deletion of hydrogen bonds resulted in higher kcat, lower T50%, and lower melting point (Tm). The new variants were found to have 6-7°C lower Tm than wild type. The large surface loop and its hydrogen bonding with the next monomer was found to be important for the stability and activity of the Vibrio alkaline phosphatase. Molecular movement analyses were also used get a better understanding of the movements of the enzyme.

Issued Date
12/10/2010


Artifacts
Name[Sortable]Size[Sortable]Visibility[Sortable]Description[Sortable]Format
Meistararitgerð.pdf16.1MBOpen Complete Text PDF View/Open