EnglishisÍslenska

Member institutions

Search in


ThesisUniversity of Iceland>Verkfræði- og náttúruvísindasvið>B.S. verkefni>

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1946/8875

Titles
  • is

    Áhrif óvenjulegs lykkjusvæðis í fosfatasa úr sjávarörveru á stöðugleika, hreyfanleika, og ensímvirkni

  • The role of an unusual loop region in a phosphatase from a marine organism in stability, flexibility and enzyme activity

Published
May 2011
Abstracts
  • is

    Þróunarferli ensíma er eitt af því merkilegasta og mikilvægasta í aðlögun lífs á jörðinni. Náttúruval veldur því að ákveðnar amínósýruraðir varðveitast og jafnvel væri betra að tala um þróun orkulandslags frekar en sameindaraða. Í kuldaaðlögun hafa þær stökkbreytingar, innsettningar og jafnvel úrfellingar varðveist sem leiða til aukinnar hvötunar við lág hitastig. Nægur sveigjanleiki við hvarfstöð er lykilatriði í hvötun og í kuldaaðlögun hefur náttúruval leitt til þess að varmastöðugleika á ákveðnum svæðum hefur verið fórnað fyrir aukin sveigjanleika. Sveigjanleiki á og í kringum stórar yfirborðslykkjur er talinn gegna stóru hlutverki í hvötun við lág hitastig. Í þessu verkefni er haldið áfram með mælingar á alkalískum fosfatasa úr Vibrio (VAP) sjávarörveru þar sem skoðað var betur hlutverk yfirborðslykkju í hvötun og á stöðugleika og tvö stökkbrigði voru skoðuð sérstaklega, F355Y og S79A/S87G, en það síðarnefnda hefur áður sýnt sérstaklega mikla hvötun. VAP er tvíliða sem hefur sýnt eina mestu hvötunargetu við lágt hitastig sem til þekkist í fjölskyldu alkalískra fosfatasa. Fylgst var með afmyndun ensímsins með afmyndaranum urea, með flúrljómunarmælingum, en sérstaklega var fylgst með afmynduninni m.t.t sundrun tvíliða. Flúrljómunarniðurstöður benda til þess að afmyndun ensímsins sé þriggja ástanda ferli þar sem tvíliður sundrast fyrst en síðan fylgir afmyndun einliða. Einnig bentu flúrljómunarferlarnir til þess að við sundrun tvíliða myndist einhvers konar ,,molten globule“ einliðu millistig. Heildarfríorka fyrir afmyndun var svo metin með ,,linear extrapolation“ aðferðinni með flúrljómunarferlum og virkniferlum og var fríorkan 35,8 kJ/mól fyrir villigerð og fríorkan fyrir sundrun tvíliða mældist ˂ 1 kJ/mól. Heildarfríorkan mældist um 7,9 kJ/mól minna fyrir F355Y og 8,9 kJ/mól minna fyrir S79A/S87G miðað við villigerð. VAP inniheldur tvær zink og eina magnesíum í hvarfstöð og var athugað hvort stökkbrigðin innihéldu þá málma einnig. Kom í ljós að S79A/S87G hafði misst eina zink en haldið í magnesíum á meðan F355Y sýndi minni tilhneigingu til að halda í magnesíum (mælt með atómgleypni). Niðurstöður hraðafræðimælinga bentu jafnframt til þess að S79A/S87A sýni meiri hvötun en hins vegar mælist kcat/KM fyrir F355Y 2590 s-1 mM-1 en áður hafði verið sýnt fram á minni hvötun fyrir það stökkbrigði.

  • Evolutionary progression of enzymes is one of the most important thing for general evolution of life. Natural selection is the main factor to determine what amino acid sequences are preserved, or even better paraphrased: is the main factor for determination of preserved energy landscapes of enzymes. In cold adaption, mutations, inserts and deletion are preserved if they contribute to more catalytic activity as needed at low temperatures without compromizing stability and substrate affinity. Flexibility near the active site is a crucial point in catalysis and in natural selection, global or regional specific stability has been sacrificed for better flexibility. The flexibility of surface loops and around surface loops has been determined an important factor for cold adaption. In this project general measurements for a cold adapted alkaline phosphatase, from a Vibrio (VAP) marine organism, were continued on the properties of two mutants, F355Y and the double mutant S79A/S87G, of which the latter has been shown to have increased rate of catalysis. VAP is a dimeric enzyme with the highest reported catalytic efficiency for known AP‘s. Urea denaturation experiments were performed and monitered with fluorescence of tryptophan residues with special emphasis on dimeric dissociation. The experiments confirm that the denaturation mechanism fits a three state model in which dimers dissociate first, followed with monomer denaturation. The fluorescence measurements likewise indicate a molten globule-like monomeric intermediate after dimeric dissociation. The overall Gibb‘s free energy was evaluated with the linear extrapolation method using the fluorescence and activity reduction measurments. It was found to be 35,8 kJ/mole for the wild type and the dimerization free energy was less then 1 kJ/mole. Both the mutants showed fewer free energy of denaturation; 7,9 kJ/mole and 8,9 kJ/mole less than the wild type for F355Y and S79A/S87G, respectively. VAP containes two zink and one magnesium ions in its active site and they are considered crucial for activity. The S79A/S87G mutant had lost one zink ion while F355Y had less affinity for magnesium as measured by atomic absorption. Kinetic measurements still showed increased catalytic efficiency for S79A/S87G but F355Y showed also showed higher kcat/KM of 2590 s-1 mM-1. F355Y had previously been shown to have lower catalytic efficiency and lower affinity for substrate than the wild type.

Comments
is

Kóðar í MATLAB fyrir flúrljómunargögn fylgja ritgerðinni.

Issued Date
31/05/2011


Artifacts
Name[Sortable]Size[Asc]Visibility[Sortable]Description[Sortable]Format
Heildartexti Yfirf... .pdf5.07MBOpen Complete Text PDF View/Open