ÍslenskaenEnglish

Aðilar að Skemmunni

Leit eftir:


LokaverkefniHáskóli Íslands>Verkfræði- og náttúruvísindasvið>Meistaraprófsritgerðir>

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/10784

Titlar
  • Áhrif saltbrúa og yfirborðshleðslna á hitastigsaðlögun subtilísin-líkra serín próteinasa

  • en

    Effect of salt bridges and surface charges on temperature adaptation of subtilisin-like serine proteinases.

Útgáfa
Febrúar 2012
Útdrættir
  • Byggingarlegar forsendur hitastigsaðlögunar próteina úr lífverum sem lifa við öfgafullar aðstæður hafa verið mikið rannsakaðar undanfarna áratugi. Ein aðferð til að rannsaka hitastigsaðlögun er að bera saman ensím úr hitakærum lífverum við skyld ensím úr kuldakærum lífverum.
    Aqualysin I (AQUI) er mjög hitastöðugur subtilísin-líkur serín próteinasi (subtilasi) úr hitakæru bakteríunni Thermus aquaticus. Bygging og eiginleikar AQUI hafa verið bornir saman við samstofna ensím úr lífveru sem er aðlöguð að kaldari aðstæðum með það að markmiði að skilja betur eðli hitastigsaðlögunar. Eitt slíkt ensím er subtilasi frá kuldakæru Vibrio-tegundinni PA-44 (VPR). Þessir tveir skyldu subtilasar hafa mjög líkar 3D byggingar, en mjög mismunandi virkni og stöðugleika. Tilgátur eru um að eitt megineinkenni hitastöðugra ensíma sé stíf myndbygging þeirra, sem felur í sér að þau ráða yfir umtalsvert lægri heildar- eða staðbundnum sveigjanleika í samanburði við samstofna miðlungs- og kuldakær prótein. Hitakær ensím hafa því venjulega yfir að ráða miklum hitastöðugleika, en hafa oft lága hvötunargetu. Vísbendingar eru um að aukinn fjöldi og/eða styrking saltbrúa spili mikilvægt hlutverk í aukningu hitaþolni hjá hitakærum ensímum, með því að stífa byggingu þeirra.
    Samanburður á 3.stigs byggingum AQUI og VPR hefur leitt til þeirrar tilgátu að aukinn fjöldi saltbrúa spili hlutverk í auknum hitastöðugleika AQUI í samanburði við VPR. Til að prófa þessa tilgátu var beitt markvissum stökkbreytingum til að leita vísbendinga um hvað hefði áhrif á þennan mikla mun í hitastöðugleika þessara annars mjög líku próteina.
    Hérna verður lýst nokkrum stökkbrigðum bæði hjá AQUI og VPR þar sem við tókum út saltbrýr og skiptum út hlöðnum amínósýrum.
    Framkallaðar voru þrjár stökkbreytingar í VPRΔC sem var ætlað að setja inn saltbrú, E172-K142, sem er til staðar í AQUI, en ekki í VPR. Sýndu einföldu stökkbrigðin VPRΔC Q142K og VPRΔC S172E mikla aukningu í hvötunargetu sem gekk svo til baka í tvöfalda stökkbrigðinu VPRΔC S172E/Q142K. Einnig verður fjallað um stökkbrigði í AQUI þar sem saltbrúin á milli E172-K142 var felld út í stökkbrigðinu AQUIK142Q. Hafði stökkbreytingin ekki marktæk áhrif á stöðugleika og hvötunargetu ensímsins. Fjórfölda stökkbreytingin AQUIx4 (H119A/R120S/R121G/A123S) sýndi ennfremur litla breytingu í eiginleikum miðað við ensím villigerðarinnar. Stökkbrigðið AQUID98S sýndi hins vegar mikla aukningu í hvötunargetu miðað við AQUIwt en sýndi þó ekki lækkun í stöðugleika. Var aukin hvötunargeta talin vera vegna fækkunar á vetnistengjum við hvarfefnisbindiset ensímsins.
    Stökkbreytingunni AQUIR47E var ætlað að taka út mögulega saltbrú á milli R47-D212 og að skipta um yfirborðshleðslu. Hækkaði hvötunargeta stökkbrigðisins umtalsvert og mældist einnig nokkur hækkun í stöðugleika.

  • en

    Structural basis of temperature adaptation of proteins from extremophiles have been extensively studied during the last decades. One method to study thermostabilization is to compare enzymes from thermophilic organisms with homologous enzymes from psychrophilic organisms.
    Aqualysin I (AQUI) is a highly thermostable subtilisin-like serine proteinase (subtilase) from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. In order to gain a better understanding of the molecular mechanisms of temperature adaptation of subtilases, the structure and properties of AQUI were compared to a homologous enzymes from organisms adapted to lower environmental temperatures. One such enzyme is a subtilase from a psychrotrophic Vibrio-species PA-44 (VPR). These two homologous subtilases have very similar 3D structures, but differ significantly with respect to catalytic activity and stability. It has been suggested that one of the main characteristic of thermophilic enzymes is highly rigid protein structures, with markedly lower global or local flexibility when compared to their meso- and psychrophilic counterparts. As a result thermophilic enzymes are usually characterized by low catalytic efficiency and high thermal stability. It has been suggested that the increased number of enforced salt bridges may play an important role in thermostabilization of thermophilic enzymes, hence in rigidifying their structure.
    Structural comparison of AQUI and VPR led us to hypothesize that additional salt bridges may play a role in thermostabilization of AQUI. To test this hypothesis we have used site directed mutagenesis to search for clues of molecular reasons for the large difference in thermostabilization of these otherwise very similar proteins.
    Here will be described few mutations both on AQUI and VPR where we deleted salt bridges and exchanged charge amino acids.
    Three mutants of VPRΔC were produced that were designed to incorporate a new ion pair, E172-K142, into the structure of VPR, which was deemed to be present in AQUI. The single mutants, VPRΔC Q142K and VPRΔC S172E, showed a significant increase in catalytic activity which did reverse however in the double mutant VPRΔC S172E/Q142K. A mutant of AQUI was also designed to delete the salt bridge between E172-K142 (AQUIK142Q). The mutation had no significant effect on the catalytic activity or thermal stability of the enzyme. The fourfold mutant AQUIx4 (H119A/R120S/R121G/A123S) showed no significant difference in either catalytic property or stability when compared to the wild type enzyme. The mutant AQUID98S showed significant increase in catalytic activity compared to AQUIwt but without any effect on thermal stability. In the AQUIR47E, mutant which, the mutation was supposed to eliminate a putative salt bridge between R47-D212 as well as to exchange the charge at this surface location. This mutant showed considerable increase in catalytic activity and also increased to some extent the thermal stability of the enzyme.

Birting
3.2.2012


Skrár
NafnRaðanlegtStærðRaðanlegtAðgangurRaðanlegtLýsingRaðanlegtSkráartegund
Brynjar Örn_ritgerd.pdf7,3MBOpinn Heildartexti PDF Skoða/Opna