ÍslenskaenEnglish

Aðilar að Skemmunni

Leit eftir:


LokaverkefniHáskóli Íslands>Heilbrigðisvísindasvið>Meistaraprófsritgerðir>

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/11831

Titlar
  • en

    Gene expression differences within an in vitro germinal center

  • Breytingar á genatjáningu í ræktunarlíkani af kímstöðvarhvarfi

Útgáfa
Maí 2012
Útdrættir
  • en

    Eight families in Iceland have been identified with multiple cases of monoclonal gammopathies (MG), including monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS), multiple myeloma (MM) and Waldenström’s macroglobulinemia (WM). It has also been shown that there is a multi-step transformation from MGUS to MM. An in vitro poke-weed mitogen (PWM) stimulation assay identified 13 disease-free relatives of patients within four of the eight families as having hyper-responding (HR) B-lymphocytes (B cells) producing Ig at > 2 Standard Deviations (SD) above controls. We established an in vitro model of the germinal center (GC) reaction and performed gene expression (GE) analysis on unstimulated samples and those collected after 14 days in the GC culture to investigate if the GC model faithfully mimics in vivo GC. We also screened for differences between controls (related and unrelated) and the HR group. B cells were isolated from peripheral blood (PB) samples from each HR (n=11), unrelated control (UC; n=11), and related (RC; n=9). mRNA was extracted immediately from B cells at day 0 and then from B cells after 14 days of stimulation in the in vitro GC culture and used to synthesize cDNA. Cy-3 labeled samples were loaded onto oligonucleotide microarrays. GE was normalized and appropriate linear-mixed effects models were applied to prepared data for analysis between study groups and stimulation days. Maximum likelihood and likelihood ratio tests and Benjamini and Hochberg correction were applied. Analysis methods included unsupervised hierarchical cluster analysis and ontology group testing using software programs recommended by the GO database. Day 0 and day 14 GE results clustered separately on a heatmap. Approximately one-third (14,277) of gene transcripts were significantly different after 14 days in the GC culture (padjusted < 0.001). Significant genes were ranked by t-statistic to identify the most up- and down- regulated genes. These genes grouped into multiple ontology classes as expected. The most up-regulated genes were involved in ontology groups, such as cell proliferation, DNA packaging and repair, apoptosis and cell survival, which mimicked those described by previous studies as being specific to the GC compartment in vivo. No significant differences were detected between the HR study group and the control groups when adjusted for multiple testing, but data which were unadjusted for multiple testing revealed different expression of 45 gene transcripts on day 14 and 198 gene transcripts on day 0 (praw < 0.001). The GE results suggest that the culture model faithfully mimics an in vivo GC response but some improvements could be fitted to the model. The HR group as a whole does not display a significantly different gene expression pattern (GEP) but an additional, later time point for sample collection might give insights or more significant results in the HR group.

  • Átta fjölskyldur hafa verið skilgreindar á Íslandi með mörg tilfelli af einstofna mótefnahækkun (monoclonal gammopathies (MG)), þar á meðal „monoclonal gammopathy of undetermined significance“ (MGUS), mergæxli (multiple myeloma (MM)) og Waldenströms makróglobulinemíu (WM). Einnig hefur verið sýnt fram á umbreytingu á MGUS í MM í nokkrum skrefum. Með örvunarprófi í frumuræktun með poke-weed mitogeni (PWM) fundust 13 heilbrigðir ættingjar sjúklinga í fjórum af þessum átta fjölskyldum með ofursvarandi (hyper-responding (HR)) B-frumur sem framleiddu immúnóglóbúlín í magni sem var > 2 SD yfir meðaltali viðmiða. Við komum upp frumuræktunarlíkani af kímstöðvarhvarfinu (germinal center (GC)) og framkvæmdum genatjáningarranssókn á óörvuðum sýnum og sýnum sem safnað var eftir 14 daga í GC rækt til að kanna hvort GC líkanið gefur rétta mynd af kímstövarhvarfi í líkamanum. Við skimuðum einnig fyrir mun milli viðmiða (skyldra og óskyldra) og HR hópsins. B frumur voru einangraðar úr blóðsýnum frá 11 ofursvörum, 11 óskyldum viðmiðum og 9 skyldum viðmiðum. mRNA var einangrað strax úr B frumum á degi 0 og síðan úr B frumum eftir 14 daga örvun í kímstöðvarlíkaninu og notað til þess að framleiða cDNA. Cy-3 merkt sýni voru sett á fákirna örflögur (oligonucleotide microarrays). Genatjáning var normalíseruð og viðeigandi ANOVA líkön notuð á undirbúin gögn til greiningar milli hópa og daga. Beitt var prófun fyrir mestu líkum (maximum likelihood) og líkindahlutfalli (likelihood ratio) og leiðréttingu samkvæmt Benjamini og Hochberg. Við greiningu var m.a. beitt „unsupervised hierarchical cluster analysis“ og prófun fyrir „ontology“ hópum með hugbúnaði sem mælt er með hjá Gene Ontology gagnagrunninum. Niðurstöður genatjáningar sýndu ólíka flokkun á hitakorti (heatmap) milli daga 0 og 14. Um það bil þriðjungur (14,277) genaumrita var marktækt breyttur eftir 14 daga í kímstöðvarræktuninni (padjusted < 0.001). Genin flokkuðust í marga flokka eins og við var að búast. Mest margfaldur munur (fold change (FC) differences (FC > 2.5)) kom fram fyrir fjölmörg gen og flokka, svo sem frumufjölgun, DNA pökkun og viðgerð, stýrðan frumudauða og frumulifun, og samrýmdist vel þeim breytingum sem fyrri rannsókn hefur lýst sem sértækum fyrir kímstöðvarfrumur í líkamanum. Enginn marktækur munur kom fram milli ofursvara (HR hóps) og viðmiðunarhópa þegar leiðrétt var fyrir endurteknum prófunum en ef ekki var leiðrétt sýndu 44 gen ólíka tjáningu á degi 14 (praw < 0.001). Niðurstöður genatjáningarrannsóknarinnar gefa til kynna að ræktunarlíkanið gefi raunsanna mynd af kímstöðvarhvarfi í líkamanum. Ofursvararnir (HR hópurinn) sem heild sýndi ekki marktækt frábrugðið genatjáningarmynstur. Unnið er að frekari greiningum.

Birting
25.5.2012


Skrár
NafnRaðanlegtStærðRaðanlegtAðgangurRaðanlegtLýsingRaðanlegtSkráartegund
HRSMScThesis.pdf3,01MBOpinn Heildartexti PDF Skoða/Opna