is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár)

Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/15748

Titill: 
  • Titill er á ensku The revival of promiscuous sulfatase activity in the cold-active Vibrio alkaline phosphatase
  • Endurvirkjun á súlfatasafjölvirkni í kuldavirkum alkalískum fosfatasa úr Vibrio örveru
Námsstig: 
  • Bakkalár
Útdráttur: 
  • Útdráttur er á ensku

    Modern enzymes have primarily one specific function. However, most enzymes contain remnants of catalytic activity of another type from their evolutionary past in a suppressed form. These evolutionary remnants can be divided into promiscuous activity and dormant activity, depending on whether these remnants still catalyse chemical reactions (to a measurable degree) or whether the necessary residues are merely present, but the enzymes require a minor adjustment to become active again. Promiscuous activity has long been considered important for protein evolution and this may also apply to dormant activity.
    The hypothesis of this project is that it is possible to re-awaken the dormant activity of an enzyme and, thus, turn it into a promiscuous enzyme. The aim was to re-awaken arylsulfatase activity in the Vibrio alkaline phosphatase (VAP). Computational calculations were used to compare the electrostatic potential in E. coli alkaline phosphatase (has sulfatase activity) with the electrostatic potential of VAP. Our preliminary results confirmed that the sulfatase activity of wild-type VAP is negligible compared to that of E. coli alkaline phosphatase. Computational calculations were used to compare the electrostatic potential in E. coli alkaline phosphatase (has sulfatase activity) with the electrostatic potential of VAP. According to our calculations, four mutations (T112A/R113E/W274K/H116D) are necessary to revive promiscuous activity in VAP. In this project the mutants containing the W274K and T112A/R113E/W274K mutations were studied. The preliminary results showed clearly detectable promiscuous activity in the T112A/R113E/W274K mutant. These results are promising.
    Another hypothesis was that the re-awakening of sulfatase activity would also re-awaken β-lactamase activity in VAP. The mutants that were studied did not show detectable β-lactamase activity. Furthermore, in addition to measuring their promiscuous activity, the kinetic behaviour and heat stability of the mutants and the wild-type enzyme were studied.
    Finally, the effects of a number of different variables on the kinetic behaviour and global structural heat stability of VAP were studied. The results indicate that the length of the amino acid connection between the Strep-tag and the C-terminus, and the concentration of ethylene glycol and MgCl2, have significant effects on the kinetic behaviour of the enzyme. The results also suggest that the Tm value of VAP is significantly higher in a buffer containing low concentration (1 mM) of MgCl2 or MgSO4, than in a buffer without MgCl2 or MgSO4.

  • Nútíma ensím hafa nær einungis eina sértæka virkni. Í flestum ensímum er hinsvegar að finna leifar af annarskonar virkni í bældu formi, sem er arfur frá frumensímum. Þessum hvötunarleifum er hægt að skipta upp í fjölvirkni (e. promiscuous activity) og sofandi virkni (e. dormant activity), eftir því hvort breiðari virkni er mælanleg í ensíminu eða hvort lítið þurfi að breytast í hvarfstöð ensímsins svo virknin birtist. Fjölvirkni hefur lengi verið talin mikilvæg fyrir þróun ensíma og það sama má segja um sofandi virkni.
    Tilgáta þessa verkefnis var sú að hægt sé að breyta ensímum í fjölvirk ensím með því að vekja upp sofandi virkni sem er í dvala í ensímbyggingunni. Markmið þessa verkefnis var að vekja upp arylsúlfatasavirkni í alkalískum fosfatasa úr Vibrio örveru (VAP). Bráðabirgðaniðurstöður staðfestu að súlfatasavirkni VAP væri hverfandi samanborið við alkalískan fosfatasa úr E. coli. Samkvæmt tölvuútreikningum, þar sem rafsvið í alkalískum fosfatasa úr E. coli (sem er virkur súlfatasi) var borið saman við VAP, er nauðsynlegt að framkvæma fjórar stökkbreytingar (T112A/R113E/W274K/H116D) til þess endurvirkja súlfatasafjölvirkni í VAP. Í þessu verkefni voru aðeins skoðuð tvö stökkbrigði, W274K og T112A/R113E/W274K. Niðurstöðurnar sýndu fram á greinilega súlfatasafjölvirkni í T112A/R113E/W274K stökkbrigðinu. Þessar niðurstöður lofa góðu.
    Önnur tilgáta er sú að með því að endurvekja súlfatasavirkni myndi einnig vakna upp β-lactamasavirkni í VAP. Stökkbrigðin sýndu enga sýnilega β-lactamasavirkni. Auk þess að skoða fjölþreifni stökkbrigðanna, var hvötunargeta og hitastöðugleiki þeirra rannsakaður.
    Áhrif nokkurra mismunandi þátta á hvötunargetu og hitastöðugleika VAP voru einnig rannsökuð. Niðurstöðurnar sýndu fram á að lengdin á amínósýrutengingunni á milli Strep-tag og C-enda ensímsins, og styrkur ethylen glýkóls og MgCl2, hefur marktæk áhrif á hvötunargetu ensímsins. Niðurstöðurnar bentu einnig til þess að Tm gildi VAP væri hærra í buffer sem inniheldur lágan styrk (1 mM) af MgCl2 eða MgSO4 en í buffer sem inniheldur ekki MgCl2 eða MgSO4.

Samþykkt: 
  • 12.6.2013
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/15748


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Tinna Pálma BS.pdf46.2 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna