Ákvörðun á grunn-stökkbreytihraða Streptococcus zooepidemicus ST-246 og ST-248 og tengsl ST-246 við hitasóttarfaraldur í íslenska hrossastofninum árið 1998

Abstract

Bakterían S. zooepidemicus er hluti af normalflóru hrossa en tilteknir stofnar bakteríunnar hafa þó verið tengdir við fjölda sjúkdóma. Til að mynda hefur verið sýnt fram á með notkun fjölsvæða arfgerðagreiningar (MLST) að stofn bakteríunnar af raðgerð 209 olli faraldri öndunarfærasjúkdóms (smitandi hósta) í íslenska hrossastofninum árið 2010. Það sama ár fundust einnig stofnar af raðgerðum (ST) 246 og 248 innan MLST kerfisins. Sýnt var að þessir stofnar væru eldri en svo að þeir hefðu valdið faraldrinum, en frekara mat á tímasetningu komu þeirra til landsins fór ekki fram. Í þessu verkefni var ætlunin að greina ST-246 og ST-248 stofna úr safni óþekktra stofna frá 2013. Jákvæð sýni skyldu raðgreind og raðgreiningargöng borin saman, með Bayesian greiningu, við gögn frá 2010 til þess að meta grunn-stökkbreytihraða á basa á ári fyrir stofnanna. Þannig yrði metið hvenær stofnarnir bárust fyrst til Íslands. Áður en verkefnið hófst var komuárið gróflega áætlað fyrir ST-246 með því að gera ráð fyrir sama stökkbreytihraða og þegar hafði verið ákvarðaður fyrir hinn náskylda S. equi. Sú nálgun gaf árið 1996. Að auki framleiðir ST-246 fjölræsisvakana SzeN og SzeP, sem hugsanlega gætu valdið einkennum á borð við þau sem fundust í hrossum með hitasótt. Þessi atriði lögðu grunn að tilgátu um að ST-246 hefði valdið áður óútskýrðum hitasóttarfaraldri í íslenska hrossastofninum árin 1998-2000.Til að greina stofna af ST-246 og ST-248 úr sýnasafni frá 2013 var sérhæft qPCR próf þróað og jákvæð sýni raðgreind. Að raðgreiningu lokinni kom í ljós að ekkert sýnanna sem tiltæk voru fyrir rannsóknina var ST-246. Vegna þessa reyndist ekki mögulegt að prófa tilgátuna um hvort S. Zooepidemicus, ST-246, hefði valdið hitasóttarfaraldrinum árin 1998-2000 með því að ákvarða grunn-stökkbreytihraðann. Aftur á móti fundust 6 sýni af ST-248 og biðu þau gögn enn úrvinnslu þegar ritgerðinni var skilað. Til viðbótar við komudagsetninguna var ákveðið að leita óbeinna sönnunargagna á hlutverki ST-246 með því að framkvæma óbeint ELISA próf á sermi hrossa með og án hitasóttar frá faraldrinum 1998-2000 og sermi frá fyrir- og eftir faraldurinn að auki. Tölfræðilega marktækur munur kom fram á mótefnaframleiðslu gegn SzeP, en ekki SzeN samkvæmt iELISA prófi á sýnum sem tekin voru fyrir og eftir faraldurinn. Þessar niðurstöður nægja einar og sér hvorki til að styðja né hrekja tilgátuna um að ST-246 hafi valdið hitasóttarfaraldrinum árin 1998-2000.

Although historically considered a commensal of horses, strains of S. zooepidemicus are now associated with a range of equine diseases. For example, multilocus sequence typing (MLST) has shown that a strain of the sequence type (ST) 209 of S.zooepidemicus was the causal agent of an epidemic of respiratory disease in the Icelandic horse population in 2010. Isolates recovered from Icelandic resident horses in 2010 also included strains of ST-246 and ST-248 in the multilocus sequence typing (MLST) scheme. These strains are thought to predate the epidemic but no further estimation was ever carried out on the date of their emergence in Iceland. The goal of this project was to identify ST-246 and ST-248 strains from a set of isolates recovered from Icelandic resident horses in 2013, sequence them and compare sequence data, using Bayesian analysis, with data from 2010 to estimate the core mutation rate per site per year for these strains, thus allowing estimation of the date at which these strains first entered Iceland. Assuming the same core mutation rate as previously identified in its close relative, S. equi, the arrival date of ST-246 was approximated prior to the beginning of the project. This placed the arrival of ST-246 at the year 1996. In addition, it was observed that ST-246 produces the potentially pyrogenic superantigens SzeN and SzeP. Together, these formed the basis of the hypothesis that a strain of ST-246 was the causal agent of an epidemic of pyrexia in the Icelandic horse population in 1998-2000.In order to identify strains of ST-246 and ST-248 from a sample archive from 2013, a specialised qPCR test was developed and positive isolates selected for sequencing. Whole genome sequencing showed that none of the samples available for the project were ST-246 and the hypothesis that S. zooepidemicus of this strain was the causal agent of the epidemic in 1998-2000 could thus not be tested by determination of core mutation rate. 6 isolates however, proved to be ST-248 and determination of the core mutation rate was underway at the date of submission of this thesis. In addition to the estimation of the date of entry, an indirect ELISA was carried out on horse serum from pyrexic and non–pyrexic horses in 1998-2000 as well as serum that pre- and post-dated the epidemic, to determine if there was serological evidence for this hypothesis. The iELISA showed statistically significant difference between antibody production to SzeP but not SzeN between samples which pre- and post dated the epidemic in 1998-2000. These data were neither sufficient to support the hypothesis that strains of ST-246 caused the epidemic nor to disprove it.