is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár)

Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/24729

Titill: 
  • Titill er á ensku The effect of different rotamers of histidine-70 on the reaction rates of aqualysin I, a subtilase from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus
Námsstig: 
  • Bakkalár
Útdráttur: 
  • Subtilín-líkir serín próteasar hafa lengi vel verið notaðir sem módelprótein í próteinverkfræði til þess að öðlast betri skilning á virkni og stöðugleika próteina. Þetta verkefni er hluti af stærra verkefni sem hallast að samanburðatilraunum á ensíminu aqualysin I (AQUI) úr hitaaðlöguðu bakteríunni Thermus aquaticus við samstofna ensím úr kuldakærri Vibriotegund (VPR). Í fyrra verkefni var framkvæmd stökkbreytingin D98S á AQUI og olli það tvöföldun í hverfitölu (kcat), þreföldun í hvötunarhæfni (kcat/KM) og engu marktæku tapi á hitastöðugleika. Í þessari tilraun var N68Q stökkbreyting framkvæmd á AQUI í von um að líkja eftir D98S stökkbreytingunni að hluta til. Tölvulíkan sýndi fram á að D98S stökkbreytingin stuðlaði að einni stellingu histidíns (His70) á hvarfstöð á kostnað annarra stellinga. Tölvulíkan af stökkbrigðinu N68Q sýndi svipuð einkenni á His70 og því varð stökkbreytingin fyrir valinu. Til þess að meta afleiðingar N68Q stökkbreytingar þá var stökkbrigðið borið saman við villigerð. Hitastigsstöðugleiki N68Q minnkaði ekki marktækt samkvæmt TM og T50% mælingum. Hraðafræðiniðurstöður sýndu fram á minni breytingar en búist var við þar sem KM fór úr 1,00 mM (± 0,05 mM) í 0,81 mM (± 0,05 mM) og hverfitalan (kcat) fór úr 33,3 s-1 (± 4,6 s-1) í 33,6 s-1 (± 5,7 s-1), á meðan hvötunarhæfnin (kcat/KM) breyttist ekki marktækt með stökkbreytingunni. Mældir hraðafræðifastar á villigerðinni í þessu verkefni höfðu nokkur frávik frá öðrum mældum gildum frá fyrri verkefnum á sömu tilraunastofu.

  • Útdráttur er á ensku

    Subtilisin-like serine proteases have proven to be useful as model proteins in protein engineering to better understand catalytic activity and stability of proteins. This project is a part of a larger research project which focuses on comparison of the enzyme aqualysin I (AQUI) from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus with a homologous enzyme from the psychrotrophic Vibrio-species (VPR). In earlier parts of the project, it was observed that catalytic activity (kcat) was doubled, the catalytic efficiency (kcat/KM) tripled and no loss of thermostability was observed in the variant AQUI_D98S. Computer simulations of the D98S variant showed that one of the histidine rotomers (His70), in the catalytic site, was more prevalent compared to the wild type. The variant N68Q showed similar results in computer simulations and it was hypothesized that it might have similar characteristics. This project was an attempt to define the N68Q variant’s characteristics experimentally. The AQUI_N68Q variant was produced and the Michaelis-Menten kinetics, and thermostability experiments were conducted. The observed thermostability of the variant showed no significant deviations from the wild type. The kinetic characteristics for the variant changed less than expected with KM dropping from 1.00 mM (± 0.05 mM) to 0.81 mM (± 0.05 mM) and the turnover-number (kcat) dropping from 33.3 s-1 (± 4.6 s-1) to 33.6 s-1 (± 5.7 s-1) with no significant change in catalytic efficiency (kcat/KM) compared to the wild type. Observed kinetic parameters of the wild type of AQUI in this project were different from the kinetic parameters measured before in other projects in the same lab.

Samþykkt: 
  • 27.5.2016
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/24729


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Bs. Arnór Freyr Sævarsson. His70-rotomers of AQUI.pdf6.89 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna