ÍslenskaenEnglish

Aðilar að Skemmunni

Leit eftir:


LokaverkefniHáskóli Íslands>Heilbrigðisvísindasvið>Meistaraprófsritgerðir>

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/6051

Titlar
  • Auðkenning próteina sem tengjast Aquaporin 4 próteininu

  • en

    Identification of proteins interacting with Aquaporin 4

Útgáfa
Ágúst 2010
Útdrættir
  • Aquaporin 4 (AQP4) próteinið er helsta vatnsflutningsprótein í miðtaugakerfi spendýra. AQP4 finnst í mestu magni á þeim stöðum þar sem heilavefur liggur að blóði eða heilahimnuvökva, eins og t.d í stjarnfrumum sem umlykja háræðar heilans og ependymal frumum við heilahol. Staðsetning AQP4 innanfrumu er skautuð, í stjarnfrumum finnst það fyrst og fremst við blóð-heila múrinn í endafótum við háræðar og í ependymal frumum er það einungis staðsett basolateral. Margar rannsóknir benda til þess að AQP4 sé staðsett í endafótunum af dystrophin prótein flókanum, það er hins vegar ekki vitað hvernig AQP4 tengist honum. Á innanfrumu C-enda sínum hefur AQP4 röð sem er þekkt fyrir að bindast PDZ (PSD-95, DLG, ZO-1) hneppum en velþekkt hlutverk próteina sem innihalda PDZ hneppi er að staðsetja himnuprótein á ákveðnum svæðum í himnum fruma. Sú tilgáta hefur verið sett fram að α- Syntrophin, sem er PDZ prótein og tilheyrir dystrophin prótein flókanum, bindist AQP4. Þetta er byggt á því að AQP4 tapar staðsetningu sinni í heilum α-Syntrophin-/- músa. Það hefur hins vegar ekki verið sýnt fram á það hingað til að AQP4 bindist α-Syntrophin né nokkru öðru PDZ próteini. Í þessari rannsókn sem er byggð á niðurstöðum sem áður fengust með Y2H (Yeast two hybrid) skimun, var notast við in vitro greiningaraðferðina GST (Glutathione-S-Transferase) niðurtog sem og ónæmislitanir til að auðkenna prótein sem bindast við innanfrumu C-enda AQP4. Auk þess var þróað samræktunarmódel með stjarnfrumum úr músum og HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) frumum með það að markmiði að líkja eftir myndun endafóta stjarnfruma in vivo. Með því að nota Syntrophin mótefni sem þekkir α, β1 og β2 Syntrophin ísóformin til að skoða niðurstöður GST niðurtogs sem framkvæmt var á frumulysati 293T fruma á western blotti kom í ljós að Syntrophin úr 293T frumum binst AQP4 PDZ háð en í Y2H skimuninni sýndi α-Syntrophin ekki bindingu við AQP4. Hugsanlegt er að AQP4 bindist α-Syntrophin beint en bindingin greindist ekki í Y2H mögulega vegna rangra breytinga á próteininu eftir þýðingu. Einnig gæti AQP4 bundist α-Syntrophin óbeint gegnum áður óþekktan millilið eða bundist β1 eða β2 Syntrophin beint en bæði próteinin eru hluti af dystrophin prótein flókanum líkt og α-Syntrophin. Sýnt var fram á að AQP4 binst sértækt við tíunda PDZ hneppi Mupp1 (Multiple PDZ domain protein 1). Engu að síður sýndu AQP4 og Mupp1 ekki sömu staðsetningu in vitro í frumurækt né in vivo í heila og nýrnasneiðum. Hins vegar var áður óþekkt binding AQP4 við PDZ próteinið Patj, sem er náskylt Mupp1, uppgötvuð með GST niðurtogi. Patj og AQP4 sýndu sömu staðsetningu í frumuhimnum í frumurækt og í kringum háræðar heilans í heilasneiðum úr músum. Þessar niðurstöður benda til þess að AQP4 og Patj bindist hvort öðru í endafótum stjarnfruma. Þetta er í fyrsta skipti sem sýnt er fram á PDZ háða bindingu AQP4 við önnur prótein og gæti mögulega aukið skilning á virkni AQP4 og varpað ljósi á það hvernig það er staðsett í endafótum stjarnfruma.

  • en

    The Aquaporin 4 water channel is the primary aquaporin in the mammalian central nervous system. The highest concentration of AQP4 is observed where the brain interfaces with blood and cerebrospinal fluid such as in astrocytes surrounding brain capillaries and ependymal cells lining the ventricles. AQP4 displays a polarized subcellular distribution. In astrocytes it is chiefly found in perivascular endfeet at the blood brain barrier and in ependymal cells it is located basolaterally. Strong evidence indicate that AQP4 is anchored at the perivascular endfeet by the dystrophin complex, it is however not known how AQP4 is linked to the dystrophin complex. At its cytoplasmic C-terminal AQP4 contains a sequence motif known to interact with PDZ domains. A well known function of proteins containing PDZ domains is to localize membrane proteins to specific subcellular domains. It has been hypothesized that α-Syntrophin, which is a PDZ protein and a member of the dystrophin complex, interacts with AQP4, based on the observation that AQP4 is mislocalized in the brains of α-Syntrophin mutant mice. However to date AQP4 has not been shown to interact with α-Syntrophin or any other PDZ domain protein. In this study, which is based on a previously performed Y2H screen, the in vitro protein interaction assay GST pulldown as well as immunostaining of tissue sections and cell cultures were used to identify proteins interacting with the cytoplasmic C-terminal of AQP4. Additionally, a coculture model of primary mouse astrocytes and HUVECs was developed to model the formation of astrocyte endfeet in vivo. Using a Syntrophin antibody that recognizes the α, β1 and β2 Syntrophin isoforms to visualize the results of a GST pulldown carried out on 293T cell lysate on western blot revealed that a Syntrophin, endogenous to 293T cells, interacts with AQP4 in a PDZ specific manner. However, in the Y2H screen α-Syntrophin did not interact with AQP4. It is possible that AQP4 interacts directly with α-Syntrophin and the Y2H result is a false negative possibly due to incorrect post translational modification. However, assuming that the Y2H result is true this indicates that AQP4 interacts either with α-Syntrophin indirectly through an unknown intermediate protein or directly with β1 or β2 Syntrophin that are both part of the dystrophin complex. It was demonstrated that AQP4 interacts specifically with the 10th PDZ domain of Mupp1 a PDZ scaffolding protein, yet AQP4 and Mupp1 did not show any colocalization in vitro in cell culture or in vivo in brain and kidney sections. However, a novel PDZ dependent interaction of AQP4 with the PDZ scaffolding protein Patj, a paralogue of Mupp1, was identified using GST pulldown. Moreover Patj and AQP4 colocalized at the cell membrane of 293T cells and around capillaries in mouse brain sections. These results strongly suggest that AQP4 and Patj interact in astrocyte perivascular endfeet. This is the first time AQP4 is shown to interact with other proteins in a PDZ specific manner and has the potential to shed a new light on the function of AQP4 and reveal how it is localized to the astrocyte endfeet.

Birting
24.8.2010


Skrár
NafnRaðanlegtStærðRaðanlegtAðgangurRaðanlegtLýsingRaðanlegtSkráartegund
Msc_ritgerd_Martei... .pdf2,91MBOpinn Heildartexti PDF Skoða/Opna