ÍslenskaenEnglish

Aðilar að Skemmunni

Leit eftir:


LokaverkefniHáskóli Íslands>Heilbrigðisvísindasvið>Meistaraprófsritgerðir>

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/7838

Titlar
  • en

    Isolation and expression of allergens from midges (Culicoides spp) causing insect bite hypersensitivity in horses

  • Einangrun og tjáning ofnæmisvaka úr smámýi (Culicoides spp) sem orsakar sumarexem í hestum

Útdrættir
  • Sumarexem er ofnæmi af gerð I gegn próteinum smámýs sem lifir ekki hér á landi. Ofnæmið er algengt í útfluttum hestum, um helmingur þeirra sem hafa verið tvö ár eða lengur á flugusvæðum fá sumarexem. Íslenskir hestar fæddir erlendis fá ofnæmið í minna mæli. Einangruð hafa verið 15 ofnæmisvakagen úr flugnabitkirtlum og próteinin tjáð í E. coli. Tveir þessara vaka eru Cul nub a21 og Cul nub c4. Cul nub a21 skráir fyrir óþekktu próteini en inniheldur hneppi (domain) sem hefur samsvörun við svokölluð penaeidin-peptíð sem eru flokkur cysteinríkra, sýkladrepandi peptíða í rækjum. Cul nub c4 er röð sem var veidd upp úr Culicoides nubeculosus yfirborðsfögugenasafni með bindingu próteinsins við IgE úr sumarexemhestum. Röðin hefur samsvörun við röðina EU978914 sem skráir fyrir óþekktu próteini CNSG79. Nauðsynlegt er að framleiða ofnæmisvakana í skordýrafrumum til þess að þeir séu rétt sykraðir og sem líkastir þeim náttúrulegu. Markmiðið var að einangra og raðgreina að fullu Cul nub a21 og Cul nub c4, tjá þau í skordýrafrumum og hreinsa a21 próteinið. Einnig að setja V5 tjáningarmerki á pFastBac HT B ferju sem er notuð við tjáningu próteina í skordýrafrumum.
    V5 merkihali úr pcDNA3.1/V5-His B ferju var settur inn á pFastBac HT B og virkar vel í próteingreiningu. Genin voru mögnuð upp úr cDNA lambdasafni gerðu úr bitkirtlum C. nubeculosus, límd inn í pFastBac HT B-V5 og pFastBac HT B og síðan raðgreind, a21 er 1218 basapör (405 amínósýrur) en c4 1254 basapör (418 amínósýrur).
    Cul nub a21 og Cul nub c4 voru tjáð í Sf-9 skordýrafrumum með Baculoveirukerfi. Endurraðaðar baculoveirur voru efldar og títreraðar og próteinraðbrigðin magnframleidd og prófuð. Einnig voru framleidd fjölstofna mótefni í músum gegn E. coli framleiddum a21 og c4 hlutapróteinum. Bæði próteinin tjáðust í innlyksum í Sf-9 frumunum. Í ónæmisþrykki var a21 raðbrigðið 53 kDa greint með fjölstofna músamótefnunum en a21-V5 55 kDa greint með V5 sérvirkum mótefnum. Músamótefnin sem framleidd voru gegn c4 hlutapróteininu bundu ekki skordýrafrumuframleidda c4 raðbrigðið, en c4-V5 sýndi 57 kDa band í ónæmisþrykki. Mögulegt reyndist að hreinsa eðlissvipt a21 með His-Select Nickel affinity geli.
    Áríðandi er að framleiða ofnæmisvakana sem líkasta náttúrulegu próteinunum þar sem sykrun getur ráðið miklu um ofnæmisvirkni. Einnig er hentugt að hafa hreinsaða ofnæmisvaka úr mismunandi framleiðslukerfum til að vinna með í ónæmismeðferð á sumarexemi. En a21 E. coli raðbrigðið er einn af þeim ofnæmisvökum sem byrjað er að nota í bólusetningartilraunum á hestum.

  • en

    Insect bite hypersensitivity (IBH) of horses is an IgE mediated allergic reaction to proteins from salivary glands of biting midges (Culicoides spp.). These insects are not indigenous to Iceland. All horse breeds can get IBH, but it is especially common in Icelandic horses exported from Iceland. If not protected against the midges they get IBH at a frequency of 50% after two years or more in Culicoides infested areas. Icelandic horses born abroad get IBH at a much lower frequency. Fifteen allergens have been isolated from salivary glands and expressed in E. coli. Two of these allergens are Cul nub a21 and Cul nub c4. Cul nub a21 codes for an unknown protein containing a domain homologous to penaeidin peptides, a group of cysteine rich, antimicrobial peptides in shrimps. The Cul nub c4 gene sequence was deduced from a phage surface display cDNA library based on the binding of the c4 protein to IgE from horses with IBH. The nucleotide sequence is homologous to EU978914 coding for the protein CNSG79. It is important to produce the allergens in insect cells to get correct glycosylation and folding. The aim of this study was to isolate and sequence Cul nub a21 and Cul nub c4, express the proteins in Sf-9 insect cells and purify Cul nub a21. Furthermore to ligate a V5 tag into the pFastBac HT B vector, used for protein expression in insect cells.
    V5 tag from pcDNA3.1/V5-His B vector was ligated into pFastBac HT B. The genes were amplified from cDNA lambda library made from C. nubeculosus salivary glands, ligated into pFastBac HT B-V5 and pFasBac HT B and sequenced, a21 is 1218 basepairs (bp) (405 amino acids (aa)) and c4 is 1254 bp (418 aa).
    Cul nub a21 and Cul nub c4 were expressed in Sf-9 insect cells in a Baculovirus system. Recombinant baculoviruses were amplified and the recombinant proteins produced and tested. Polyclonal antibodies were made in mice against the E. coli produced partial proteins a21 and c4. Both proteins were expressed in inclusion bodies in the Sf-9 cells. In Western blot (WB) the recombinant a21 was detected as a 53 kDa protein with the polyclonal mouse antibodies but the recombinant a21-V5 was 55 kDa with monoclonal V5 antibodies. The polyclonal mouse antibodies made against the c4 partial protein did not bind to the Sf-9 produced whole recombinant c4 protein, but the recombinant c4-V5 showed a 57 kDa band in WB with the monoclonal V5 antibodies. It was possible to purify denatured a21 with His-Select Nickel affinity gel.
    It is of importance to produce the allergens in the natural form or at least with the correct glycosylation for testing the allergenicity. It is also useful to have purified allergens produced with different expression systems to use for immunotherapy. The recombinant a21 made in E. coli is one of the allergens that are now being tested in a vaccine experiment in Icelandic horses.

Birting
1.4.2011


Skrár
NafnRaðanlegtStærðRaðanlegtAðgangurRaðanlegtLýsingRaðanlegtSkráartegund
masters ritgerð Heida.pdf1,84MBOpinn Heildartexti PDF Skoða/Opna