ÍslenskaenEnglish

Aðilar að Skemmunni

Leit eftir:


LokaverkefniHáskóli Íslands>Heilbrigðisvísindasvið>Meistaraprófsritgerðir>

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/8548

Titlar
  • Ættlæg einstofna mótefnahækkun og æxli af B eitilfrumuuppruna: afbrigði í kímstöð?

  • en

    Familial monoclonal gammopathies and B cell derived malignancies: abnormalties in the germinal centre?

Skilað
Júní 2011
Útdrættir
  • Kímstöðvar eru svæði í eitilvef þar sem virkjaðar B eitilfrumur ganga í gegnum frumufjölgun, sækniþroskun og flokkaskipti og sérhæfast í plasma- eða minnisfrumur. Talið er að æxlisvöxtur af B eitilfrumuuppruna eigi rætur að rekja til mistaka eða afbrigða í B frumuviðbragðinu í kímstöð þegar fruman leyfir genaóstöðugleika til skamms tíma. Einstofna mótefnahækkun (monoclonal gammopathy) er dæmi um slíkan sjúkdóm sem einkennist af tilvist einstofna mótefnis og endurspeglar góðkynja eða illkynja fjölgun B eitilfrumna af sama stofni. Á undanförnum fimm áratugum hefur um 130 fjölskyldum verið lýst með ættlæga tilhneigingu til einstofna mótefnahækkunar og þar af eru átta íslenskar fjölskyldur. Í fjórum þessara íslensku fjölskyldna hafa samtals fundist tólf heilbrigðir fjölskyldumeðlimir sem hafa ofursvarandi B frumur með aukna mótefnaframleiðslu eftir örvun. Þessir einstaklingar kallast ofursvarar.
    Þessi rannsókn skiptist í tvo hluta; aðferðarþróun og kímstöðvarrækt. Markmið aðferðarþróunarinnar var að kanna mun á frumufjölda með notkun ferskra og frystra sýna og að þróa aðferðir til að einangra RNA og DNA úr B eitilfrumum. Aðalmarkmið rannsóknarinnar var að kanna hvort B eitilfrumur ofursvara sýndu afbrigði í innri og ytri svipgerð í kímstöðvarviðbragði.
    Gerður var samanburður á ferskum og frystum einkjarna blóðfrumusýnum úr sjálfboðaliðum til þess að kanna mun á frumufjölda. Nokkrar aðferðir voru prófaðar við einangrun á RNA úr örvuðum og óörvuðum frumum og einangrun á DNA úr óörvuðum frumum og rauðkornaþykkni, til þess að fá sem mest magn af hreinu RNA/DNA úr sem minnstum fjölda B frumna. Í aðalrannsókninni á kímstöðvarhvarfinu tóku ellefu ofursvarar þátt ásamt skyldum og óskyldum viðmiðum af sama aldri og kyni. B frumur voru einangraðar og prófaðar í ræktunarlíkani sem líkir eftir lífeðlisfæðilegum aðstæðum kímstöðvar og ræktaðar í þrjár vikur. Í lok hverrar viku var tekið sýni og gerð mótefnalitun gegn ákveðnum yfirborðsviðtökum og umritunarþáttum sem tengjast þroskaferli í kímstöð og tjáning þeirra skoðuð í frumuflæðisjá.
    Fleiri B eitilfrumur fengust þegar notast var við fersk einkjarna blóðfrumusýni en fryst sýni. Til að fá sem mest magn af heildar RNA reyndist best að geyma frumurnar í RNAlater og einangra svo með RNeasy Mini Kit. Mest magn af hreinu DNA úr B eitilfrumum og rauðkornaþykkni fékkst með QIAamp Mini Kit einangrun. Kímstöðvarlíkanið reyndist endurspegla mjög vel raunverulegt kímstöðvarsvar B eitilfrumna. Ofursvarar sýndu engin afbrigði í tjáningu yfirborðsviðtakanna CD86, CD95, CD38, CD27, CD70 og CD32 samanborið við viðmið. Tjáning BCL-6 og BLIMP1 var mjög breytileg í kímstöðvarræktum sem má skýra vegna tilviljunarkenndrar tjáningar umritunarþátta. Ofursvarar sýndu hærra BLIMP1/BCL-6 hlutfall í kímstöðvarviðbragðinu samanborið við viðmið. Það gefur til kynna að frumur ofursvara séu talsvert líklegri til að sérhæfast í plasmafrumur en frumur viðmiða og gæti verið hluti af breytingum sem svo leiða til einstofna mótefnahækkunar.

  • en

    Germinal centres are structures in lymphoid tissues where activated B lymphocytes go through proliferation, affinity maturation and class switch recombination and differentiate into plasma or memory B cells. It is believed that tumour growth of B cell origin can be traced to mistakes or abnormalities in the B cell response in germinal centres when the cell allows short term genetic instability. Monoclonal gammopathy is an example of such a disease, characterized by the presence of monoclonal antibody, reflecting benign or malignant expansion of a single clone of B cell. About 130 families with multiple cases of monoclonal gammopathies have been described, of which eight are Icelandic. In four of these Icelandic families, a total of twelve healthy family members have been found to have hyper-responding B cells with increased antibody production after stimulation. These individuals are called hyper-responders.
    This study was divided into two parts; methods development and germinal centre culture. The aim of the methods development was to compare the cell count of fresh and frozen samples and to develop suitable methods for the isolation of RNA and DNA from B cells. The main aim of this study was to analyze whether B cells from hyper-responders showed aberrations in internal and external phenotype in the germinal centre response.
    Samples of fresh and frozen mononuclear cells from volunteers were compared to evaluate the cell count. Several methods were compared to see which one gave the highest amount of pure RNA from a minimal number of stimulated and unstimulated B cells, and which one gave the highest number of pure DNA from a minimal number of unstimulated B cells and granulocytes. For the main study of the germinal centre reaction samples were collected from eleven hyper-responders and age- and gender-matched controls. B cells were isolated and tested in a culture model that mimics biological conditions of the germinal centre, and cultured for three weeks. At the end of each week a sample was removed and the cells stained with antibodies against specific surface receptors and transcription factors related to the development in the germinal centre, and their expression analyzed by flow cytometry.
    Fresh samples gave higher B cell counts than frozen samples. The highest amount of pure RNA was obtained when the B cells were stored in RNAlater and isolated with RNeasy Mini Kit but the highest amount of pure DNA from unstimulated B cells or granulocytes was obtained with use of QIAamp Mini Kit isolation. The culture model reflected well expected events in the germinal centre reaction. Samples from hyper-responders showed no differences from control samples in expression of the surface receptors CD86, CD95, CD38, CD27, CD70 and CD32. Expression of BCL-6 and BLIMP1 was highly variable in the germinal centre cultures which can be explained by the stochastic expression of transcription factors. Hyper-responders showed significantly different behavior of the relative expression of BLIMP1 and BCL6 from controls. This indicates that cells from hyper responders are considerably more likely to differentiate into plasma cells than cells from controls and might be a part of alterations that lead to monoclonal gammopathies.

Samþykkt
17.5.2011


Skrár
NafnRaðanlegtStærðRaðanlegtAðgangurRaðanlegtLýsingRaðanlegtSkráartegund
lokaritgerd_pdf.pdf4,7MBOpinn Heildartexti PDF Skoða/Opna