ÍslenskaenEnglish

Aðilar að Skemmunni

Leit eftir:


LokaverkefniHáskóli Íslands>Heilbrigðisvísindasvið>Meistaraprófsritgerðir>

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/8894

Titlar
  • Afbrigði í geislaskautum og DNA viðgerð í BRCA2 arfblendnum frumum

  • en

    Centrosomal abberations and DNA repair in BRCA2 heterozygous cells

Útgáfa
Júní 2011
Útdrættir
  • Stökkbreyting í æxlisbæligeninu brca2 eykur áhættuna á að fá brjóstakrabbamein. Ein af fyrstu breytingum sem sjást í myndun krabbameinsfrumna er mögnun eða afbrigðilegt útlit á geislaskautum. Geislaskaut leika stórt hlutverk við skipulagningu á örpíplum sem mynda skiptispólu þegar fruman skiptir sér í tvær dótturfrumur að lokinni mítósu. Sýnt hefur verið fram á að sé BRCA2 ekki til staðar getur það leitt af sér fjölgun geislaskauta. Aðalhlutverk BRCA2 er þó í viðgerðaferli fyrir tvíþátta DNA brot, þar sem það, ásamt Rad51 og fleiri próteinum, tekur þátt í þáttaparaviðgerð (HR).
    Unnið var með 12 frumulínur í þessu verkefni, 9 voru upprunnar frá þekjuvef í brjósti, 1 frá brisvef og 2 frá bandvef í húð. Af þessum báru 7 stökkbreytingu í brca2 geninu. Arfblendnar voru 6 með: 999del5, 4700del4 og 6872del4. Þá var lína var með 6174delT breytingu, auk þess að hafa tapað hinni brca2 samsætunni, notuð sem neikvætt viðmið. Frumulínurnar skiptust í 2 hópa eftir hvaða aðferð var notuð til að gera þær ódauðlegar, E6/E7 eða hTERT. Við talningu geislaskauta sýndu 4 af 5 prófuðum frumulínum með brca2 stökkbreytingu marktækt fleiri frumur með fjölgun geislaskauta miðað við eðlilega viðmiðslínu, sem er án stökkbreytingar í brca2. Til að kanna nánar hvort frumur með aðeins eitt starfhæft eintak af BRCA2 sýndu merki um BRCA2 skort voru frumurnar geislaðar til að kalla fram tvíþátta DNA brot. Staðfest voru tvíþátta brot með litun fyrir γH2AX hjá öllum línum 5 klst eftir geislun og hjá öllum línum, nema neikvæða viðmiðinu (brca2 -/-), hafði brotunum fækkað 48 klst eftir geislun. Viðgerðarhæfni var skoðuð með litun gegn Rad51. Allar frumulínur nema neikvætt viðmið (brca -/-) gátu myndað Rad51 viðgerðarflóka. Þegar 48 klst voru liðnar frá geislun höfðu allar frumulínur í E6/E7 hópnum ennþá marktækt fleiri frumur með γH2AX bletti en eðlilega viðmiðið sem hafði nánast lokið viðgerð. hTERT frumulínurnar og bandvefsfrumur sýndu sambærilegar niðurstöður og eðlilega viðmiðið 48 klst eftir geislun. Ekki var munur á brca2 stökkbreyttum frumulínum og línum án stökkbreytinga sem gerðar voru ódauðlegar á sama hátt en marktækur munur var á frumulínuhópum eftir því hvort þeir voru E6/E7 eða hTERT breyttir. Ein arfblendin frumulína með BRCA2 stökkbreytingu (A176) skar sig þó úr og sýndi verri viðgerðarhæfileika en viðmiðunarlínan fyrir E6/E7 aðferðina.
    Frumuhringsgreining sýndi færslu á frumum frá G1 fasa yfir í G2/M fasa hjá öllum frumulínum nema jákvæða viðmiðinu þegar bornar eru saman geislaðar línur á móti ógeisluðum 48 klst eftir geislun. Staða í frumuhring studdi niðurstöður um tvíþátta brot þar sem hTERT línur sýndu minni uppsöfnun í G2/M en E6/E7 línurnar og voru líkari MCF7, eðlilegu viðmiði, þar sem viðgerð virðist nánast lokið. Erfitt var að meta hvort G1 eftirlitsstöðin sé virk þar sem virkni hennar er mest á öðrum tímapunkti.
    Frumulínurnar sem notaðar voru í þessu verkefni gætu nýst til að kanna áhrif lyfja sem beint er gegn krabbameinsfrumum sem hafa tapað BRCA2 próteininu og eru þannig ófærar um að gera við tvíþátta DNA brot. Niðurstöður gætu hjálpað til við að meta áhrif lyfja á einstaklinga sem bera arfblendna stökkbreytingu í brca2 geninu, með tilliti til aukaverkana.

  • en

    Mutations in the tumor suppressor gene brca2 increase the risk of developing breast cancer. One of the first changes detected in cancer cells is centrosome amplification and altered centrosomal morphology. The main function of the centrosome is to organize microtubules to form a bipolar spindle and guide chromosomes into the two daughter cells after mitosis. It has been shown that loss of BRCA2 can be associated with centrosomal amplification. The main role of BRCA2 is to take part in repair of DNA double strand breaks, where it, in collaboration with RAD51 and other proteins, is one of the key components in the homologous recombination repair pathway.
    Twelve cell lines were used in this study, nine mammary epithelial cell lines, one pancreatic cell line and two fibroblast cell lines derived from skin. Seven of those carried a brca2 mutation. Six are heterozygous for one of the following mutations: 999del5, 4700del4 or 6872del4, and one cell line with the 6174delT mutation has lost the wild-type copy. The cell lines divided in two groups based on which method was used to immortalize them, HPV16 E6/E7 or hTERT. Four out of five cell lines carrying brca2 mutation, showed centrosomal amplification compared to normal control. To investigate further if cells with only one functional brca2 gene show lack of BRCA2 function double strand DNA breaks were created with ionizing radiation. γH2AX staining confirmed double strand breaks in all cell lines 5 hours after irradiation and all cell lines, except the negative control (brca2 -/-) showed a lower percentage of cells with breaks 48 hours after irradiation, indicating successful repair. Rad51 staining was used to evaluate the ability to form ds DNA break repair foci. All cell lines, except the negative control were able to create Rad51 repair foci. All cell lines immortalized with E6/E7 still showed significantly higher numbers of cells with γH2AX foci than the normal control, 48 hours after irradiation, but the normal control had almost finished the repair process. Cell lines immortalized with hTERT and the fibroblast cell lines showed similar results as the normal control. Cell lines carrying a brca2 mutation and cell lines without one did not show a difference in repair capability but the method of immortalizing, E6/E7 or hTERT, produced a significant difference between the cell lines in each group. One brca2 mutated cell line (A176), stood out and showed poorer outcome in double strand break repair than the control line, also immortalized with E6/E7 but without mutation.
    All cell lines, except the normal control, showed a shift from G1 to G2/M in cell cycle analysis when untreated samples were compared to irradiated samples 48 hour after irradiation. Results on double strand DNA breaks were supported by cell cycle analysis where the hTERT group showed less accumulation in G2/M faze than the E6/E7 cell lines and looked more like the normal control, MCF7 that had almost finished the repair pathway. Evaluation of the G1 checkpoint response was difficult because it is more active at another time point.
    The cell lines used in this project could be used as a model to evaluate the effect of drugs specifically aimed at BRCA2 deficient cancer cells. The results could help estimate the side effects the drug could have on individuals carrying a brca2 mutation.

Birting
1.6.2011


Skrár
NafnRaðanlegtStærðRaðanlegtAðgangurRaðanlegtLýsingRaðanlegtSkráartegund
jbth pdf.PDF1,8MBOpinn Heildartexti PDF Skoða/Opna