Quantification of the Lipids 5-HETE, 12-HETE and LTB4 in Cultured Cancer Cells after Treatment with Protolichesterinic Acid

Abstract

Certain behaviour is characteristic for cancer cells regardless of their place of origin. These characteristics are the so called hallmarks of cancer consisting of biological capabilities acquired during the multistep development of human tumours. Lipids play an important role in these characteristics, one of which is the lipoxygenase (LOX) pathway. The role of LOX in the development and progression of cancer is complex and 5- and 12-hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs) have e.g. been shown to facilitate angiogenesis and are associated with higher staging of breast cancer. The lichen secondary metabolite protolichesterinic acid (PA) has been found to be a significant 5-LOX inhibitor in vitro and also a potent 12-LOX inhibitor. High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) has improved specificity and sensitivity in targeted lipid analysis and is an increasingly popular choice for the quantification of eicosanoids.The aims of this project were to develop an efficient sample preparation technique to maximize the recovery of 5-HETE, 12-HETE and leukotriene B4 (LTB4) in matrix, validation of the method and to stimulate 5-LOX and 12-LOX pathways in cultured SK-BR-3 breast cancer cell line. The secondary objective was quantifying the eicosanoids with HPLC-MS/MS in samples from SK-BR-3 cancer cells treated with PA.The results show that solid phase extraction with acidified cartridge, samples and wash, and basic elute was the optimal sample preparation method. The method validation with medium as matrix was within acceptable criteria. Stimulation of SK-BR-3 to secrete 5-HETE and 12-HETE was a success although the results were misleading at first sight. PAs ability to inhibit 5- and 12-LOX pathways was unfortunately not evaluated because of fault in the implementation of the experiment.

Ákveðnir eiginleikar eru einkennandi fyrir krabbameinsfrumur, óháð staðsetningu og uppruna þeirra innan líkamans. Þetta eru líffræðilegir eiginleikar sem frumurnar þróa með sér í gegnum hin mörgu skref æxlismyndunar. Lípíð gegna mikilvægu hlutverki í efnaskiptum krabbameinsfrumna og tekur lipoxygenasi (LOX) þar þátt. Hlutverk LOX í þróun og framrás krabbameins er flókið, t.d. hefur verið sýnt fram á að 5- og 12-hydroxýeicósatetraenóic sýrur (HETE) hvetja æðanýmyndun í æxlum og er hækkaður styrkur þeirra í blóði brjóstakrabbameinssjúklinga tengdur hærri stigum sjúkdómsins. Annars stigs fléttuefnið prótólichesterínsýra (PA) hefur sýnt hemjandi virkni á 5-LOX in vitro, auk þess að vera 12-LOX hindri. Vökvagreining með raðtengdum massagreini (HPLC-MS/MS) er sértæk og næm aðferð sem í auknum mæli hefur verið nýtt við magngreiningu eicósanóíða líkt og 5- og 12-HETE og leukotríens B4 (LTB4). Markmið þessa verkefnis var að þróa skilvirka sýnameðhöndlunar aðferð til að hámarka endurheimtur á 5- og 12-HETE og LTB4. Önnur markmið voru að gilda aðferðina og að þróa aðferð til að örva 5-LOX og 12-LOX ferla hjá ræktuðum SK-BR-3 krabbameinsfrumum. Að síðustu átti að reyna að beyta aðferðunum við magngreingu á þessum þremur eicósanóíðum með HPLC-MS/MS í frumuæti eða PBS af SK-BR-3 frumum sem meðhöndlaðar höfðu verið með PA. Tilgangurinn var að meta hindrunarhæfni PA á 5- og 12-LOX.Niðurstöðurnar sýndu að ákjósanlegasta sýnameðhöndlunaraðferðin var súluskiljun þar sem súlan, sýnið og vökvinn sem notaður er til að skola súluna eru sýrð og efnunum náð af súlunni með basískum lífrænum leysi. Gilding aðferðarinnar með frumuæti var innan viðmiða. Örvun SK-BR-3 frumna í að seyta 5-HETE og 12-HETE heppnaðist, þó að niðurstöðurnar hafi virst misvísandi í fyrstu. Ekki tókst að meta hindrunar hæfni PA á 5- og 12-LOX vegna galla í hönnun tilraunarinnar.