Hitastigsaðlögun aqualysins I, subtilisín-líks serín próteinasa úr hitakæru bakteríunni Thermus aquaticus

Abstract

Byggingarlegar forsendur hitastigsaðlögunar meðal subtilasa af próteinasa K fjölskyldunni úr örverum sem aðalagast hafa mismunandi hitastigi hafa mikið verið rannsakaðar. Þetta verkefni er hluti af stærra rannsóknarverkefni, þar sem samanburður hefur verið gerður á eiginleikum og byggingu subtilasa úr kuldaþolinni Vibrio tegund (VPR) og aqualysíni I úr hitaþolnu bakteríunni Thermus aquaticus (AQUI). Kristalbyggingar ensímanna hafa verið ákvarðaðar og hafa samanburðarrannsóknir verið gerðar á byggingu þeirra og fjöldi stökkbreytinga verið framkvæmdar, til þess að reyna að skilja hitastigsaðlögun þeirra betur. Útfrá samanburði á þrívíddarbyggingu ensímanna hafa verið hannaðar breytingar inn í byggingu VPR sem taldar eru hafa stöðugleikaaukandi áhrif og eru til staðar í AQUI. Einn þeirra byggingarþátta sem talið er að stuðli að auknum hitastöðugleika AQUI er aukinn fjöldi saltbrúa í hitaþolna ensíminu. Til að prófa þessar tilgátur, hefur verið felld út saltbrú í AQUI með markvissri stökkbreytingu, en metið var útfrá þrívíddarbyggingu að til staðar séu saltbrýr í AQUI umfram VPR, og er ein þessara hugsanlegu saltbrúa á milli Arg43 og Asp212 í AQUI. Til að kanna frekar hlutverk saltbrúa á hitastöðugleika AQUI, var stökkbreytingin D212N framkvæmd, sem fellir út saltbrú á milli Arg43 og Asp212. Áhrif útfellingarinnar voru könnuð m.t.t. stöðugleika og virkni ensímsins, en niðurstöður mælinganna sýndu fram á lækkun í hitastöðugleika um 2°C, en aftur á móti mældist ekki marktækur munur í virkni miðað við villigerðarensímið.