Magngreining á fosfólípíðum í himnuflekum úr rottuhjörtum með 31P NMR

Abstract

Himnuflekar eru þéttpökkuð, hreyfanleg örsvæði í frumuhimnu sem samanstanda af sphingolípðum, fosfólípíðum, kólesteróli og próteinum. Þeir taka þátt í ýmsum mikilvægum ferlum innan frumunar. Til að mynda eru himnuflekar vettvangur fyrir boðflutning og taka einnig þátt í að flytja prótein inn í frumur og milli frumulíffæra innan frumu. Tilgangurinn með þessu verkefni var að greina fosfólípíð í himnuflekum úr rottuhjarta með 31P NMR, sem er nákvæm og næm aðferð fyrir lítil sýni. Himnuflekar voru einangraðir með súkrósustigli úr hjörtum fullorðinna rotta. Prótein- og GM1-þerriblettunar mælingar voru gerðar á 12 skömmtum súkrósustigulsins til að staðfesta að einangrun hefði gengið eftir. Fosfólípíð voru dregin út og einangruð úr þrem hlutum af súkrósustiglinum sem skilgreind voru sem himnuflekar. Heildarfosfólípíð og undirflokkar þeirra í himnuflekum voru magngreind með 31P NMR mælingum. Einnig var gerð 31P NMR mæling á fosfólípíðum einangruðum úr heilu hjarta til samanburðar. Samsetning fosfólípíða í himnuflekum var eftirfarandi (mólprósenta): Fosfatidylkólín, 51,9%, fosfatidyletanólamín, 27,0%, fosfatidyletanólamín plasmalogen, 11,7% og sphingomýelín, 9,4%. Fosfólípíðasamsetning var ólík milli sýnanna tveggja þar sem neikvætt hlöðnu fosfólípíðin fosfatidylserín og fosfatidylinositol mældust ekki í himnuflekum öfugt við það sem búist var við, heldur einungis í heilu hjarta. Einnig var munur á magni fosfólípíða milli sýna þar sem hlutfallslega meira var af sphingomyelíni og fosfatidylkólínií himnuflekum en í heilu hjarta.

Lipid rafts are tightly packed microdomains in the cell membrane that mainly consist of phospholipids, cholesterol, sphingolipids and proteins. They play an important role in various pathways in the cell. For example they are a platform for signal transduction and also play a part in transferring proteins into the cell via endocytosis and transcytosis. The purpose of this experiment was to analyze phospholipids in lipids rafts from rat hearts with 31P NMR, wich is an accurate and sensitive method for small samples. Lipid rafts were isolated on a sucrose gradient from adult rat hearts. Proteins and GM1 ganglioside were analyzed in 12 fractions of the sucrose gradient to verify that the isolation was successful. Phospholipids were extracted and isolated from three fractions of the sucrose gradient which were defined as lipid rafts. Phospholipids and their subclasses in lipid rafts were quantified with 31P NMR mesuremetns. 31P NMR measurements on phospholipids isolated from a whole rat heart were also preformed to have as a comparison. The phospholipid class compositionin lipid rafts was as follows in mol percentages: Phosphatidylcholine, 51,9%, phosphatidylethanolamine, 27,0%, phosphatidylethanolamine plasmalogen, 11,7% og sphingomyelin, 9,4%. There was a difference in the phospholipid composition between the two samples, where the negatively charged phospholipids phosphatidylserine and phosphatidylinositol were not detected in lipid rafts, in contrast to what was expected. There was also a difference in the amount of phospholipids between the samples asthere was more of sphingomyelineand phosphatidylcholine in the lipid rafts than in the whole rat heart.