is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár)

Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/14505

Titill: 
  • Áhrif valinna stökkbreytinga á alkalískan fosfatasa úr sjávarlífverunni Vibrio splenditus í leit að fjölvirkni (e. promiscuity)
  • Titill er á ensku Effects of selected mutations in the alkaline phosphatase from marine Vibrio splenditus in search of a promiscuous sulphatase activity
Námsstig: 
  • Bakkalár
Útdráttur: 
  • Lífverur jarðarinnar búa við mjög mismundandi skilyrði. Kuldakærar lífverur eru þær lífverur sem vaxa og dafna við hitastig sem er stöðugt um eða undir frostmarki. Þær þurfa að mynda kuldavirk ensím til þess að viðhalda eðlilegum efnaskiptum. Alkalískur fosfatasi úr sjávarlífverunni Vibrio (VAP) er dæmi um eitt slíkt ensím. Alkalískir fosfatasar hvata á ósértækan hátt vatnsrof eða umestrun á fosfórýl esterum. Hins vegar eru dæmi um að alkalískir fosfatasar geti hvatað aðra gerð efnahvarfa heldur en náttúruleg virkni þeirra segir til um og kallast það fjölvirkni.
    Í verkefninu voru skoðuð áhrif stökkbreytinga á VAP sem skref í þá átt að kanna fjölvirkni VAP. Samkvæmt tölvureikningum þá þarf að gera fjórföldu stökkbreytinguna T112A/R113E/H116D/W274K til þess að breyta VAP í súlfatasa og/eða laktamasa og sýna þannig fram á fjölvirkni VAP. Í verkefninu var farið áleiðis í því að búa til það stökkbrigði og framkvæmdar stökkbreytingarnar T112A/R113G og H116D. Sett var inn glýsín (G) í stað glútamik sýru (E) til þess að fá samanburð við litla hlutlausa amínósýru. Eftir stökkbreytinguna T112A/R113G reyndist hvarfstöð VAP vera óstöðugri gagnvart hita (lægra T50%) miðað við villigerðina og af því leiddi minni sækni í hvarfefnið (hærra Km). Hins vegar var hverfitalan (kcat) svipuð og hvarfgetan (kcat/Km) í heild minni. Einnig reyndist heildarbygging próteinsins (Tm) óstöðugri við há hitastig og gæti það stafað af meiri sveigjanleika próteinsins eftir stökkbreytingu. H116D hafði minni sækni í hvarfefnið miðað við villigerð líkt og T112A/R113G. Hvarfgeta H116D var um það bil 30x minni heldur en hjá villigerðinni. H116D var aftur á móti stöðugra en villigerðin og T112A/R113G við hátt hitastig. Í verkefninu voru framkvæmdar tvær stökkbreytingar í áttina að þeim fjórum sem samkvæmt útreikningum þarf til þess að vekja upp súlfatasa virkni, það dugði ekki til að vekja upp fjölvirkni hjá VAP.

  • Organisms in a permanently cold environment need to synthesize cold – active enzymes to sustain proper metabolism. Alkaline phosphatase (AP) from the marine Vibrio bacterium (VAP) is an example of such a cold – active enzyme. APs are nonspecific catalysts that catalyse hydrolysis or transesterification of phosphoryl esters. There is also some evidence that APs are promiscuous in the sense that they can catalyse another type of chemical reaction than they originally evolved to do which make them promiscuous.
    In this study we looked at the effects of residue replacements by site – directed mutagenesis that were done in search of promiscuity in VAP. According to in silico analysis the replacement of four residues might suffice to change VAP into a sulfatase, T112A/R113E/H116D/W274K. Here the VAP variants T112A/R113G and H116D were produced. Rather than replacing arginine (R) with glutamic acid (E) it was decided to replace it with glycine (G) to get comparison with a small, neutral amino acid. After the mutagenesis T112A/R113G the VAP proved to be less stable at a high temperature (lower T50%) than the wild type and it had a lower affinity for the substrate (higher Km). T112A/R113G had a similar turnover number (kcat) as the wild type but less catalytic efficiency (kcat/Km). The thermal stability of the overall structure (Tm) of T112A/R113G was also less and that is presumably due to more flexibility of the enzyme. H116D had less affinity for the substrate compared to the wild type just as T112A/R113G. The catalytic efficiency of H11D was 30x less compared to the wild type. However, H116D proved to be more stable at a high temperature than both the wild type and T112A/R113G. We carried out two of the four mutations that are needed to awake sulfatase activity in VAP according to in silico analysis. These two were not enough to promote promiscuity in VAP.

Samþykkt: 
  • 29.4.2013
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/14505


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
RITGERÐIN-loka.pdf7.21 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna