Greining DNA-skemmda af völdum PARP-hindra og vetnisperoxíðs með tvívíðum þáttháðum rafdrætti

Abstract

Tvívíður þáttháður rafdráttur (Two-dimensional strandness-dependent electrophoresis, 2D-SDE) er ný rafdráttaraðferð sem byggir á aðgreiningu kjarnsýrusameinda eftir lengd, lögun og því hvort þær eru einþátta, tvíþátta eða RNA•DNA blendingar. Verkefnið er hluti af áframhaldandi þróun tækninnar og er markmið þess að athuga hvort nota megi 2D-SDE til að greina einþátta og tvíþátta rof í DNA.Tvær aðferðir voru notaðar til þess að framkalla rof í DNA. Annars vegar voru FANCD1-/- fíbróblastar meðhöndlaðir með PARP-hindra til þess að hindra DNA viðgerðir. Til samanburðar voru svo heilbrigðar frumur meðhöndlaðar á sama hátt. Hins vegar voru heilbrigðir fíbróblastar meðhöndlaðir með vetnisperoxíði sem veldur oxunarskemmdum á DNA, þ.á.m. einþátta og tvíþátta rofum. Seinni sýnin voru einnig greind með halastjörnugreiningu (comet assay) til samanburðar við 2D-SDE. Halastjörnugreining er algengasta aðferðin sem notuð er til greiningar á rofum í DNA og er eitt af markmiðunum með þróun 2D-SDE að hanna aðferð sem er fljótlegri og handhægari en halastjörnugreining í framkvæmd.Niðurstöður verkefnisins voru að 2D-SDE gat greint rof í DNA sýnum og aðgreint sameindabrot, sem tilkomin voru vegna einþátta rofa, frá þeim sem höfðu myndast vegna tvíþátta rofa. Aðferðin reyndist þó ekki nægilega næm og greindist á heildina litið svipað magn DNA skemmda í öllum sýnum óháð styrk efna sem þau voru meðhöndluð með. Halastjörnugreining reyndist hins vegar næm á þessar gerðir skemmda en helsta takmörkun hennar var snögg mettun. Samanburður milli 2D-SDE og halastjörnugreiningar leiddi því í ljós að enn sem komið er er halastjörnugreiningin betri aðferð til greiningar á rofum í DNA úr frumuræktum.

Two-dimensional strandness-dependent electrophoresis (2D-SDE) is a new method that separates nucleic acids in samples based on their length, conformation and strandness. This research project is part of the ongoing development of the technique and its objective is to examine whether 2D-SDE can be used to detect single- and double-stranded DNA breaks. Two approaches were used to induce DNA strand breaks. On the one hand, FANCD1-/- fibroblasts were treated with a PARP inhibitor to inhibit DNA repair. For comparison, wild type cells were treated the same way. On the other hand, wild type fibroblasts were treated with hydrogen peroxide, which causes oxidative damage to DNA, including single- and double-stranded breaks. The latter samples were also analysed by the comet assay for comparison to 2D-SDE. The comet assay is the commonest detection method for DNA strand breaks and one of the objectives of the development of 2D-SDE is to design a method that is less time-consuming and easier to carry out than the comet assay. The results showed that 2D-SDE was able to detect DNA breaks in samples and separate DNA fragments, which were generated by single-stranded breaks, from those generated by double-stranded breaks. However, 2D-SDE was not sensitive enough in detecting these lesions. The amount of DNA lesions was similar in all samples and independent of the amount of the damaging agent used. The comet assay was however able to detect these lesions with good sensitivity but its main limitation proved to be its low saturation level. Thus, comparison of 2D-SDE and comet assay revealed that, as it is, the comet assay is a better method for detecting DNA breaks in cell culture samples.