is Íslenska en English

Lokaverkefni (Meistara) Háskóli Íslands > Heilbrigðisvísindasvið > Meistaraprófsritgerðir - Heilbrigðisvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/16951

Titill: 
  • Sumarexem (smámýsofnæmi) í hestum. Framleiðsla á ofnæmisvökum í skordýrafrumum og byggi
  • Titill er á ensku Insect Bite Hypersensitivity in Horses. Production of Allergens in Insect Cells and Barley
Námsstig: 
  • Meistara
Útdráttur: 
  • Sumarexem er ofnæmi af gerð I í hrossum með framleiðslu á IgE. Sjúkdómurinn orsakast af próteinum (ofnæmisvökum) úr bitkirtlum smámýs (Culicoides spp.) en það lifir ekki hér og því er sjúkdómurinn óþekktur á Íslandi. Yfir 50% af sumarexemshestum svara líka á Simulium vittatum, einu flugutegund-ina sem bítur spendýr á Íslandi. Exemið er mikið vandamál fyrir hrossaútflutning þar sem útfluttir hestar fá sumarexem í mun hærri tíðni en íslenskir hestar fæddir erlendis.
    Ellefu prótein úr bitkirtlum C. nubeculosus og fjögur prótein úr bitkirtlum S. vittatum, sem binda IgE úr sermi sumarexems hesta, hafa verið einangruð og tjáð í E. coli. Fjórir af þessum ofnæmisvökum, C. nubeculosus antigen 5, hýalúronidasi, maltasi og S. vittatum antigen 5 eru viðfangsefni þessa verkefnis. Markmiðið var þríþætt: 1) Magna upp og raðgreina hýalúronidasa og maltasa, tjá í skordýra-frumum og hreinsa próteinin. 2) Nota E. coli framleidd prótein til að framleiða fjölstofna mótefni gegn hýalúronidasa og maltasa og einstofna mótefni gegn antigen 5 og hýalúronidasa. 3) Tjá hýalúronidasa úr C. nubeculosus og antigen 5 úr S. vittatum í byggi.
    Genin voru mögnuð upp úr C. nubeculosus bitkirtla λcDNA safni og þau raðgreind. Hýalúronidasinn er 1209 bp (402 a.s.) og maltasinn er 1809 bp (602 a.s.). Genin voru tjáð í skordýrafrumum með Baculoveiru-tjáningarkerfinu.
    Fjölstofna mótefni voru framleidd gegn E. coli tjáðum e16 (32 kDa hluti af hýalúronidasa) og maltasa. Mótefnin bundust bæði E. coli- og skordýrafrumu tjáðum próteinum. Einstofna mótefni voru framleidd gegn E. coli tjáðum e16 og antigen 5. Af tólf frumublendingum sértækum fyrir e16, voru tveir klónaðar og kviðarholsvökvi framleiddur í músum. Tveir antigen 5 sértækir frumublendingar voru klónaðir og kviðarholsvökvi framleiddur í músum. Einstofna mótefnin bundust viðkomandi E. coli- og skordýrafrumu framleiddum próteinum.
    Hýalúronidasi og maltasi sem tjáðir voru í skordýrafrumum voru prófaðir í ónæmisþrykki með sértækum mótefnum. Einstofna og fjölstofna mótefnin gegn e16 sýndu hýalúronidasann sem 51 kDa band. Maltasa sértæku mótefnin sýndu hann sem 72 kDa band. Maltasinn sem er sykraður var hreinsaður og hann batt sermis IgG úr sumarexemshestum í ónæmisþrykki.
    Raðirnar sem skrá fyrir C. nubeculosus hýalúronidasa og S. vittatum antigen 5 voru tákna-bestaðar fyrir tjáningu í byggi með Orfeus™ próteintjáningarkerfinu. Skimun á T1 fræjum frá 34 byggplöntum með fjölstofna og einstofna mótefnum gegn e16 sýndu 38 kDa sértækt band í fjórum línum en mótefni gegn próteinhalanum sýndi 26 kDa band í öðrum fjórum línum. Fyrir framleiðslu á T2 fræjum var sáð frá sex línum, fjórum 38 kDa prótein jákvæðum og tveimur 26 kDa prótein jákvæðum. T2 fræ frá fjórum línunum tjáðu 38 kDa próteinið en einungis fræin frá annarri 26 kDa jákvæðu línunni. Sáð var frá þremur línum fyrir framleiðslu á T3 fræjum, frá tveimur 38 kDa prótein jákvæðum og þessari einu 26 kDa prótein jákvæðu. Byrjað var aftur á antigen 5 tjáningarferlinu með endurklónun í genaferjur þar sem engin framleiðsla var á próteininu í T2 fræjum.

  • Útdráttur er á ensku

    Insect bite hypersensitivity (IBH) or summer eczema is a type I allergy in horses with production of IgE antibodies and release of inflammatory mediators. IBH is caused by proteins from the salivary glands of Culicoides species not indigenous to Iceland, therefore the disease is unknown in Iceland. More than 50% of IBH affected horses also react to Simulium vittatum, the only haematophagous flies that bite mammals in Iceland. IBH is a major problem for the Icelandic horse export as horses born in Iceland suffer from IBH in a much higher frequency than Icelandic horses born abroad.
    Eleven salivary gland proteins from C. nubeculosus have been expressed in E. coli and four from S. vittatum, they all bind serum IgE from IBH affected horses. Four of these allergens antigen 5, hyaluronidase and maltase from C. nubeculosus and antigen 5 from S. vittatum are the subject of this thesis. The aim was threefold: 1) Amplify and sequence the hyaluronidase and maltase, express the proteins in insect cells and purify them. 2) Use the E. coli expressed proteins to produce polyclonal antibodies (pAbs) against the hyaluronidase and maltase and monoclonal antibodies (mAbs) against the hyaluronidase and antigen 5. 3) Express the C. nubeculosus hyaluronidase and S. vittatum antigen 5 in barley.
    The genes were amplified from lambda cDNA library made from C. nubeculosus salivary glands, and sequenced. The hyaluronidase is 1209 bp (402 a.a.) and the maltase is 1809 bp (602 a.a.). The genes were expressed in insect cells with the Baculovirus expression system.
    Polyclonal antibodies were raised against E. coli expressed e16 (32 kDa part of the hyaluronidase) and maltase. The antibodies reacted to both E. coli and insect cell expressed proteins. Monoclonal antibodies were raised against E. coli expressed e16 and antigen 5. Twelve e16 specific hybridomas were generated, two cloned and ascites produced in mice. Two antigen 5 specific hybridomas were obtained, cloned and ascites produced in mice. The specific mAbs bound to the E. coli expressed as well as to the insect cell expressed proteins.
    The insect cell expressed hyaluronidase was recognized as 51 kDa band in Western blot (WB) with the anti e16 pAbs and mAbs. The maltase was recognized as 72 kDa band in WB with polyclonal anti maltase. The maltase, that was shown to be glycosylated has been purified and was recognized by serum IgG from IBH affected horses.
    The sequences encoding the C. nubeculosus hyaluronidase and S. vittatum antigen 5 were codon optimized for expression in barley with the Orfeus™ expression system. Screening of T1 hyaluronidase seeds from 34 lines (primary transformants) with the anti e16 mAbs and pAbs showed specific binding to a 38 kDa protein in four barley lines, but the anti tag antibody bound specifically to 26 kDa band in four different lines. Seeds from six lines were sown for production of T2 seeds, four positive for the 38 kDa and two for the 26 kDa protein. The T2 seeds from all four lines of the 38 kDa protein were positive but only one of the two lines with the 26 kDa protein. T2 seeds from three lines were sown for production of T3 seeds, two from the lines specific for the 38 kDa protein and from the single line specific for the 26 kDa protein.
    The production of the antigen 5 was started again from the point of re-cloning the gene as there was no expression of the protein in the screening of the T2 seeds.

Samþykkt: 
  • 17.12.2013
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/16951


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
MS ritgerd_Sigridur Jonsdottir.pdf2.16 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna