is Íslenska en English

Lokaverkefni (Meistara)

Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > Meistaraprófsritgerðir - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/20505

Titill: 
  • Titill er á ensku The role of salt bridges on the temperature adaptation of aqualysin I, a subtilase from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus
  • Hlutverk saltbrúa í hitastigsaðlögun aqualysins I, subtilasa úr hitakæru bakteríunni Thermus aquaticus
Námsstig: 
  • Meistara
Útdráttur: 
  • Byggingarlegar forsendur hitastigsaðlögunar meðal subtilisín-líkra serín próteinasa (subtilasa) af próteinasa K fjölskyldunni úr örverum sem aðalagast hafa mismunandi hitastigi hafa mikið verið rannsakaðar. Samanburður hefur verið gerður á byggingu og eiginleikum tveggja subtilasa, aqualysin I úr hitaþolnu bakteríunni Thermus aquaticus (AQUI) og Vibrio próteinasa úr kuldaþolinni Vibrio tegund (VPR). Ensímin, sem aðlagast hafa mismunandi hitastigi, hafa mjög samsvarandi byggingu en eru aftur á móti frábrugðin m.t.t. virkni og hitastöðugleika og eru því hentug líkön til að rannsaka byggingarlegar forsendur hitastigsaðlögunar.
    Hitaþolin ensím eru talin hafa auknar innansameindarvíxlverkanir sem gerir þeim kleift að viðhalda virkri byggingu sinni við hátt hitastig. Einn þeirra byggingarþátta sem talið er að stuðli að auknum hitastöðugleika ensíma eru aukinn fjöldi saltbrúa. Samanburður á þrívíddarbyggingu AQUI og VPR leiddi í ljós aukinn fjölda saltbrúa í hitaþolna ensíminu. Tilgátur um stöðugleikaaukandi áhrif saltbrúa í AQUI voru kannaðar með því að fella út ákveðnar saltbrýr í ensíminu með markvissum stökkbreytingum, og líkja þannig eftir samsvarandi svæðum í kuldaþolna ensíminu. Áhrif útfellinganna voru könnuð m.t.t. stöðugleika og virkni hitaþolna ensímsins og borin saman við villigerðarensímið.
    Alls voru sex stökkbreytingar framkvæmdar á AQUI; R117Q, D58N, D98G, R43N, R43A og D212A. Útfellingin á saltbrúnni Arg43-Asp212 með stökkbreytingunum R43N, R43A og D212A. niðurstöður mælinganna sýndu að hitastöðugleikinn féll mest hjá D212A, eða um 7,1°C, miðað við villigerðarensímið. Hin stökkbrigðin sýndu fram á lækkun um 2°C. Stökkbrigðið R43A sýndi hinsvegar fram á mestan mun í virkni, þar sem niðurstöður mælinganna sýndu fram á tvölfalda aukningu í kcat og kcat/Km. Saltbrúin Arg95-Asp58 er hluti af áætluðu saltbrúar neti Asp98-Arg95-Asp58 í AQUI, og voru salbrýrnar felldar út með tveimur stökkbreytingum, D98G og D58N. Niðurstöður mælinga sýndu ekki fram á marktækan mun í hitastöðugleika fyrir stökkbrigðin. Aftur á móti sýndi stökkbreytingin D98G fram á tvöfalda aukningu í bæði kcat og kcat/Km. Stökkbreytingin R117Q var ætluð að fella út meinta saltbrú á milli Arg117 og Asp113. Niðurstöður mælinga sýndu ekki fram á marktækan mun í hitastöðugleika. Mælingar sýndu ekki fram á marktækan mun í virkni ensímsins en sækni ensímsins í hvarfefnið jókst lítillega.

  • Útdráttur er á ensku

    Enzymes of different temperature origins have been studied extensively last decades, in order to understand their temperature adaptation. Structural properties of subtilases belonging to the proteinase K family of different temperature origins have been studied, in order to improve the understanding of the temperature adaptation of these enzymes. The two homologous subtilases, aqualysin I from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus (AQUI) and the cold-adapted Vibrio protease from a Vibrio sp. (VPR), despite sharing a high structural homology they differ with respect to catalytic properties and thermal stability. Thus, they provide an excellent model for studying the molecular basis of different properties of temperature adaptation.
    Thermophilic enzymes tend to have increased intramolecular interactions, compared to their psychro- and mesophilic counterparts, that allow them to maintain their conformational stability and a certain degree of flexibility to remain active at high temperatures. Salt bridges are one of the structural factors that are believed to enhance thermal stability of enzymes, whereas enzymes adapted to high temperatures tend to have larger number of ion pairs in their structure compared to psychro- and mesophilic enzymes. Structural comparison of AQUI and VPR indicated that the thermophilic enzyme contains additional ion pairs in its structure that may play a stabilizing role at high temperature. In order to test these hypotheses we eliminated salt bridges in AQUI using site-directed mutagenesis. The mutated sites in AQUI were chosen in order to mimic the corresponding sites in the psychrophilic VPR. The mutants (R117Q, D98G, D58N, R43N, R43A, D212A) were experimentally characterized with respect to their catalytic activity and thermal stability, and compared with the wild-type enzyme.
    The mutations R43N, R43A and D212A were introduced into the structure of AQUI to eliminate the putative salt bridge Arg43-Asp212. The mutants R43N and R43A had a minor effect on the thermal stability, compared to the wild-type enzyme. However, the mutant D212A resulted in significant reduction, about 7°C. Measured kinetic parameters of the mutant R43A showed a twofold increase in kcat and kcat/Km. The salt bridge network Asp98-Arg95-Asp58 is believed to be present in AQUI, we eliminated this ion pair network by producing two mutants, D98G and D58N. Both mutants had no detectable effect on the thermal stability of the enzyme. However, results of kinetic measurements for D98G showed about twofold increase in kcat and kcat/Km. The mutant R117Q was introduced into AQUI to delete the salt bridge between Arg117 and Asp113. The mutant had minimal effects on the thermal stability, compared to the wild-type enzyme. The kinetic measurements showed no detectable change in kcat/Km, but we observed a slight increase in the affinity for the substrate.

Styrktaraðili: 
  • Rannsóknasjóður Háskóla Íslands
Samþykkt: 
  • 5.2.2015
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/20505


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Lilja Björk Jónsdóttir_nýtt.pdf2.99 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna