Implementation and verification of an analytical method for the quantification of biogenic amines in seafood products

Abstract

Rotamín (e. biogenic amines, BA) eru hitaþolin, lífræn basísk efni með hátt suðumark sem myndast í matvælum af völdum örvera vegna ensímatískra efnabreytinga á náttúrulegum amínósýrum. BA eru áhættuþáttur varðandi matvælaöryggi þar sem þau geta valdið ofnæmisviðbrögðum hjá mönnum. BA má finna í ýmsum matvælum, sérstaklega fisk af scombroid tegund (t.d. makríl, túnfisk, síld) sem ekki hefur verið rétt meðhöndlaður eða geymdur við réttar aðstæður. BA brotna ekki niður við eldun og greinast ekki við skynmat, því hefur Evrópuráðið sett reglugerð um mælingu á histamíni með HPLC aðferð ásamt hámarksgildum í fisk og fiskafurðum með reglugerð (EB nr 2073/2005).Markmið meistaraverkefnis sem hér er kynnt var að setja upp og sannprófa HPLC aðferð til að ákvarða magn histamíns og annarra BA í fiski og fiskimjöli. Aðferðin sem sett var upp er byggð á opinberri þýskari aðferð til að ákvarða BA í fiskafurðum. Uppsetning aðferðarinnar fól í sér aðferðarbestun á m.a. sýnaundirbúningi, HPLC greiningu og úrvinnslu niðurstaðna. Þar á eftir var aðferðin metin til að sannreyna að niðurstöðurnar sem fengust væru samræmdar, réttar og fullnægjandi fyrir mælingar á BA í fiski og fiskmjöli.Aðskilnaður milli mismunandi BA náðist á C18 súlu með öfugum stöðufasa og ferðafasastigli með hækkandi natríum-asetati og asetónítrili. Til að sannprófa greininguna voru breyturnar sértækni, línuleiki, mælisviðs, næmnimörk, greiningarmörk, hittni (accuracy), nákvæmni (precision) og heimtur ákvarðaðar með tölulegum gildum. Stýririt fyrir histamín var sett upp fyrir innri gæðastjórnun til að meta gæði, árangur og nákvæmni mælinganna í framtíðinni.Aðferðin reyndist vera sértæk, BA voru aðskilin frá hverju öðru, upplausn toppa var góð og línuleiki aðferðarinnar var mjög góður á fyrir styrk á bilinu 2,5-100ppm fyrir öll fjögur BA sem greind voru, þ.e. r2≥0.994. Magngreiningarmörk aðferðarinnar voru ákvörðuð sem LOQ = 0,16-0,48 ppm, og því verður jafnvel mögulegt að greina BA í mjög lágum styrk , heimtur á BA reyndust vera á bilinu 80-110%. Aðferðin var nákvæm og endurteknar niðurstöður samkvæmar hverri annarri, sömuleiðis reyndist enginn marktækur munur á niðurstöðum milli rannsóknarstofu Matís og annarra rannsóknarstofa. Nákvæmni aðferðarinnar sýndi að hlutfallslegt staðalfrávik (RSD) af flatarmáli toppa í endurteknum sýnum voru á bilinu RSD = 3-4,2% fyrir fiskhold og RSD = 4,2-5,9 % fyrir fiskimjöl, með hlutfallslegri mælióvissu 3-4% fyrir fiskhold og 5,86-8,30% fyrir fiskimjöl. Samanburðarsýni leiddi einnig í ljós litla hnikun (variation) í niðurstöðum, hlutfallslegt staðalfrávik var á bilinu 5-9% með hlutfallslega mælióvissu milli 5-7,8%.Þátttaka í samanburðarrannsóknum sýndi góðan árangur rannsóknarstofu Matís samanborið við aðrar rannsóknarstofur. Útaukin staðalóvissa var ákvörðuð vera 7,4% fyrir fisk og 11,8% fyrir fiskmjöl með hliðsjón að bjögun (bias) milli rannsóknarstofa.Rannsóknin staðfestir að niðurstöður mæliaðferðarinnar voru samanburðarhæfar, réttar og fullnægjandi fyrir greiningu á BA í fiski og fiskimjöli og mun því leiða til bætts matvælaöryggis. Ávinningar rannsóknarverkefnisins eru m.a. að Ísland getur uppfyllt matvælalöggjöf ESB (EB tilskipun nr 2073/2005) ásamt íslensku matvælalöggjöfinni og gerir framleiðendum sjávarafurða kleift að staðfesta gæði og öryggi afurðanna.

Biogenic amines (BAs) are non-volatile, heat stabile, organic basis formed in food by microorganisms through enzymatic decarboxylation of amino acid. BAs are a food safety hazard because they can trigger an allergic response in humans, they can be found in various food such as inappropriately handled and/or stored scombroid fish (e.g. mackerel, tuna, herring). Since these amines cannot be destroyed by cooking or detected with organoleptic evaluation, the European Council requires the determination of histamine in fish and fish products with HPLC and regulates the maximum levels of histamine according to the Commission Regulation (EC) No 2073/2005.The aim of this master thesis was the implementation and verification of an HPLC method for the determination of histamine and other biogenic amines in fish and fish meal. The method applied was based on an official German food testing method for the determination of BAs in fish based products. The implementation of the method included optimization of: sample preparation, HPLC analysis and data evaluation. Thereafter, the method performance was verified to demonstrate that the results obtained were consistent, correct and satisfactory for analysis of BAs in fish and fish meal.Separation of biogenic amines was achieved on a C18 reverse-phase column with gradient elution separation with a binary mixture with increasing sodium-acetate and acetonitrile. For the verification analytical parameters such as selectivity, linearity, working range, limit of detection and limit of quantitation, accuracy, precision, recovery and were determined. For internal quality control, control chart for histamine was prepared to monitor the future measurement performance and accuracy. The method was selective, the biogenic amines separated from each other with a good resolution. The analytical method demonstrated a very good linearity in the range of 2,5-100ppm for all four biogenic amines, with r2≥0.994. The limit of quantification of the method was determined as LOQ= 0,16-0,48 ppm, giving a good opportunity to measure biogenic amines even in a very low concentration. The recovery of biogenic amines ranged from 80-110%. The method was accurate, repeatable and reproducible; there were no significant differences in inter-laboratory measurements. The precision of the method showed that the relative standard deviation (RSD) of the peak areas of the replicates were in the range of RSD= 3-4,2% in the case of fish flesh and RSD= 4,2-5,9% in the case of fish meal, with a relative measurement uncertainty of 3-4% for fish flesh and 5,86-8,30% for fish meal. The reproducibility also revealed a low variations in the results obtained, the relative standard deviation was in the range of 5-9% with a relative uncertainty between 5-7,8% . Participation in proficiency testing showed that the performance of the Matís laboratory was very good compared to other laboratories. Extended relative uncertainty was determined, taking into consideration the inter- laboratory bias, to be 11,8% and 7,4% for fish meal and fish flesh, respectively.This study verified that the results obtained were consistent, correct and satisfactory for analysis of BAs in fish and fish meal will improve food safety. As a result of the thesis, Iceland will be able to comply to the EU legislation (EC directive No 2073/2005) and Icelandic regulations and enable seafood producers to confirm the quality and safety of their products