is Íslenska en English

Lokaverkefni (Meistara) Háskóli Íslands > Heilbrigðisvísindasvið > Meistaraprófsritgerðir - Heilbrigðisvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/21603

Titill: 
  • Ónæmismeðferð gegn sumarexemi í hestum. Þróun aðferða til að tjá og hreinsa endurraðaða ofnæmisvaka í skordýrafrumukerfi og notkun þeirra við að meta árangur ónæmismeðferðar
  • Titill er á ensku Immunotherapy for insect bite hypersensitivity in horses. Developement of methods for expressing and purifying recombinant allergens in insect cells and their application for evaluating immunotherapy
Námsstig: 
  • Meistara
Útdráttur: 
  • Sumarexem er húðofnæmi af gerð I í hestum sem einkennist af framleiðslu á IgE mótefnum. Einkenni sjúkdómsins eru exem og kláði sérstaklega í fax- og taglrótum, jafnvel sáramyndun og sýkingu í sárum. Sumarexem er dýravelferðarmál og vandamál fyrir hrossaútflutning þar sem tíðni þess er mun hærri hjá útfluttum hestum en hjá íslenskum hestum fæddum erlendis. Sumarexem orsakast af biti smámýs (Culicoides spp.) en þetta mý lifir ekki á Íslandi. Ofnæmisvakarnir eru prótein sem hestarnir mynda ofnæmisviðbrögð gegn og eru upprunnin í bitkirtlum flugnanna. Þrettán ofnæmisvakar hafa verið einangraðir úr þremur smámýstegundum, C. sonorensis, C. nubeculosus og C. obsoletus, tjáðir í bakteríum (E.coli) og hreinsaðir. Ferill sjúkdómsins hefur verið skilgreindur og tilraunir til ónæmismeðferðar eru í gangi. Ofnæmisvakarnir sem hreinsaðir eru úr bakteríum henta illa fyrir sum ónæmispróf sem eru nauðsynleg til að mæla árangur meðferðar. Því er nauðsynlegt að framleiða vakana í heilkjörnungum. Þar sem þeir eru upprunir úr bitkirtlum skordýrs er eðlilegast að tjá þá í skordýrafrumum.
    Markmið rannsóknarinnar var að tjá fjóra aðalofnæmisvaka; Cul n 1, Cul n 2, Cul n 4 úr C. nubeculosus og Cul o 3 úr C. obsoletus í skordýrafrumum og hreinsa þá auk Cul n 3, Cul o 1 og Cul o 2 sem áður höfðu verið tjáðir. Einnig að setja upp ónæmispróf til að meta mótefna- og boðefnasnið í kjölfar meðferðar.
    Ofnæmisvakarnir voru tjáðir í skordýrafrumum með Bac-to-Bac baculoveirutjáningarkerfi með þremur mismunandi plasmíðum; pFastBac1, pFastBac-HBM-TOPO (Honey bee melittin seytiröð) og pI-secSUMOstar (Small-ubiquitin-related-modifier sem á að auka stöðugleika og leysanleika próteina). Endurraðaðar baculoveirur voru framleiddar í Sf-9 skordýrafrumum, 6xhis-merkt endurröðuð prótein í High-five skordýrafrumum og próteinin síðan hreinsuð með nikkel perlum og himnuskiljun. Tjáning, framleiðsla og hreinsuð prótein voru prófuð með coomassie litun og í ónæmisþrykki með sérvirkum mótefnum gegn próteinunum. Elísupróf (ELISA) voru sett upp til mótefnamælinga og in vitro örvun gerð á hvítfrumum fyrir boðefnaseytingu.
    Ofnæmisvakarnir Cul n 3, Cul n 4 og Cul o 2 voru hreinsaðir á náttúrulegu formi. Sett var upp elísupróf fyrir Cul n 3 og Cul n 4 og þeir einnig notaðir við in vitro örvun á hvítfrumum úr bólusettum hestum og boðefnaframleiðsla mæld í kjölfarið. Cul n 4 var bæði hreinsaður í fullri lengd og sem SUMOstar prótein. Óklippt Cul n 4 SUMOstar samrunaprótein reyndist nothæft í elísuprófi.
    Ekki tókst að hreinsa Cul n 1, Cul n 2 og Cul o 1 tjáða með HBM seytiröð á náttúrulegu formi en Cul n 1 og Cul o 1 voru nothæfir í elísupróf eftir hreinsun á afmynduðu formi. Cul n 1, Cul n 2 og Cul o 3 voru tjáðir sem SUMOstar samrunaprótein og tókst að hreinsa þau á náttúrulegu formi en þau féllu út við himnuskiljun. Örvun hvítfrumna var ekki til lykta leidd hvorki með afmynduðum próteinum né með SUMOstar samrunapróteinum.
    Sjö ofnæmisvakar úr smámýi voru tjáðir í skordýrafrumum og sýnt fram á að fimm þeirra séu nothæfir í próf til að meta mótefna- og boðefnaframleiðslu í kjölfar ónæmismeðferðar og/eða sjúkdómsgreiningu. Sýnt var að tjáning ofnæmisvaka sem SUMOstar samrunaprótein getur auðveldað hreinsun þeirra og þau nýst óklippt í mótefnapróf.

  • Útdráttur er á ensku

    Insect bite hypersensitivity (IBH) is recurrent seasonal dermatitis of horses characterized by intense pruritus and eczema leading to excoriations which contribute to secondary infections. The lesions are mainly localized on the head, along the dorsal midline and at the base of the main and tail. IBH is an animal welfare issue and an obstacle in horse exportation as the prevalence of the disease is considerable higher in exported Icelandic horses than in horses born on the European continent. IBH is a type I allergy with production of IgE antibodies, caused by allergens of biting midges (Culicoides spp.). The midges are not indigenous to Iceland. Thirteen allergens have been isolated from three midge species, C. sonorensis, C. nubeculosus, and C. obsoletus, expressed in E. coli and purified. The pathogenesis of the disease has been studied and development of immunotherapy is ongoing. The allergens produced and purified from E. coli are not suitable for some of the immunoassays needed to evaluate immunotherapy. Therefore it is necessary to express them in eukaryotic cells and as they are originated in the salivary glands of insects, it is obvious to express them in insect cells.
    The objective of the study was to express four of the major allergens Cul n 1, Cul n 2, Cul n 4 from C. nubeculosus and Cul o 3 from C. obsoletus in insect cells and purify them in addition to Cul n 3, Cul o 1 and Cul o 2 that had been expressed before as well as to set up immunoassays for evaluation of antibody and cytokine response following immunotherapy.
    The allergens were expressed in insect cells using the Bac-to-Bac baculovirus expression system with three different vectors; pFastBac1, pFastBac-HBM-TOPO (Honey bee melittin secretion signal) and pI-secSUMOstar (Small-ubiquitin-related-modifier which increases the stability and solubility of proteins). Recombinant baculoviruses were produced in Sf-9 insect cells, 6xhis-tagged recombinant proteins in High-five insect cells followed by purification with nickel affinity resin and dialysis. Expression, production and purified proteins were tested with coomassie blue staining and Western blot using protein specific antibodies. The purified proteins were used to set up tests for measuring antibodies and cytokines.
    The allergens Cul n 3, Cul n 4 and Cul o 2 were purified under native conditions. ELISA was set up with Cul n 3 and Cul n 4 and they used for in vitro stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from vaccinated horses and cytokine production measured. Cul n 4 was purified in full length and as SUMOstar fusion protein. Uncleaved Cul n 4 SUMOstar fusion proteins could be used in ELISA.
    Expressed with HBM secretion signal Cul n 1 and Cul o 1 could only be purified under denaturing conditions and subsequently used in ELISA. Cul n 1, Cul n 2 and Cul o 3 were expressed as SUMOstar fusion proteins and purification under native conditions was successful, however, the proteins precipitated after dialysis. In vitro stimulation was not accomplished, neither with proteins purified under denaturing conditions nor with SUMOstar fusion protein.
    Seven allergens were expressed in insect cells and demonstrated that five of them were applicable for evaluating immunotherapy and/or diagnosis. Expression of allergens as SUMOstar fusion proteins may ease purification and they can be used uncleaved in ELISA.

Samþykkt: 
  • 22.5.2015
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/21603


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
MSRitgerd_SaraBjork.pdf3.4 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna