Þróun á aðferðum til einangrunar á exósómum úr frumuæti.

Abstract

Exósóm bjóða upp á marga möguleika sem örlyfjabera fyrir líftæknilyf eins og mRNA vegna stærðar, stöðugleika og sértækni. Einn mikilvægur þáttur til þess að exósóm verði raunhæfur kostur sem örlyfjaberar er góð aðferð til að einangra exósómin. Margar mismunandi aðferðir hafa verið notaðar við að einangra exósóm eins og últraskilvindun, útfellingaraðferðir og aðferðir sem að byggja á aðskilnaði eftir stærð (SEC). Þrátt fyrir ýmsar framfarir þá eru enn hindranir á veginum til að finna réttu aðferðina sem hentar best til einangrunar exósóma til notkunar sem lyfjaferju. Því þótti mikilvægt að skilgreina frekar hvernig vissar úfellingaraðferðir reynast til að einangra exósóm og hvort slíkar aðferðir væru hentugar til áframhaldandi notkunar sem lyfjaferju.Valdar voru þrjár frumulínur, basalfrumulínan BCI-N.1.1 og krabbameinsfrumulínurnar A549 og D492 til að kanna hvort að þessar frumulínur losuðu svipað magn af exósómum. Prófaðar voru fimm mismunandi einangrunaraðferðir sem byggjast á notkun úfellingarvökva (ExoQuick og ExoSpin) ásamt frekari breytingum með notkun skilvindufiltra, mismunandi skilvinduhraða og hlutfalli útfellingarvökva og ætis. Agnir voru svo greindar með ljósbroti (DLS) ásamt transmission rafeindasmásjá (TEM).Tilraunir okkar sýndu að einungis ein aðferð gaf sjáanlegt botnfall en það var ExoQuick notað samkvæmt leiðbeiningum frá framleiðanda á æti frá BCI-N.1.1. Þær agnir reyndust hafa agnir á stærðarbilinu 122-578 nm mældar með DLS en 50-80 nm þegar mældar með TEM sem svipað þvermáli exósóma (30-120 nm). Þótt að hinar aðferðirnar hafi ekki gefið botnfall var vökvinn, sem var eftir á botninum, mældur með DLS og voru þær niðurstöður mjög breytilegar. Allt frá því að hafa stærðardreifingu um 200-500 nm yfir í 6540 nm. Þessar niðurstöður sýna að aðferðir sem að byggjast á útfellingarlausnum geta verið vandmeðfarnar og frekari hámörkun aðferðanna er þörf. Einnig mætti skoða aðrar aðferðir eins og SEC til að fá meira magn af hreinum, nothæfum exósómum.

Exosomes offer many advantages as nanocarriers for biotechnology drugs such as mRNA due to their size, stability and selectivity. One crucial factor for their efficient use as nanocarriers is a robust method for exosome isolation. Methods such as ultracentrifugation, precipitation and size exclusion chromatography have been used for exosome isolation. Despite some progres emerging for these method developments, a method has yet to be identified that results in efficient isolation of pure exosomes. Therefore, the first steps in identifying an applicable method was to study the suitability of different precipitation methods for exosome isolation and their feasibility for future use as nanocarriers.Three cell lines were chosen, immortalized basal cell line BCI-N.1.1 and cancer cell lines A549 og D492 to determine wheather these cell lines released similar amount of exosome. Five different precipiation methods that use precipiation fluid (ExoQuick and ExoSpin) were studied with various changes such as centrifugation filters, different centrifugation speed and different ratio of precipitation fluid and cell culture medium. The resulting particles were then analyzed with dynamic ligth scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM).The results show that only one, ExoQuick used as instructed from the manufacturer, method gave visiable precipiation from BCI-N.1.1 cell culture medium. These particles measured 122-578 nm when analyzed with DLS and 50-80 nm when analyzed with TEM which is in line with diameter of exosomes (30-120 nm). Although the other methods did not give any visible precipitation, their isolated fluid was measured with DLS. The results were variable, with the size distribution ranging from 200-500nm up to 6540 nm. These results show that methods based on exosome precipitation were more delicate than anticipated and there is clearly a need for further optimization. Alternatively, other isolation methods such as SEC might be more suited to isolate pure exosomes in more quantitiy.