is Íslenska en English

Lokaverkefni Háskóli Íslands > Heilbrigðisvísindasvið > Meistaraprófsritgerðir - Heilbrigðisvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/24090

Titill: 
  • Titill er á ensku Correction of Dystrophin gene with Homology Directed Repair
  • Viðgerð á distrófín geni með samstæðubeindri endurröðun
Skilað: 
  • Maí 2016
Útdráttur: 
  • Útdráttur er á ensku

    The unprecedented simplicity and specificity of the RNA-guided Cas9 endonuclease system has revolutionized genome engineering and editing. It has been shown that a eukaryotic-optimized variant of the system can be used to knock in a gene sequence by specific cutting and inducing homology directed repair (HDR). The same approach has been used to repair a deletion within the DMD gene, a condition that can cause severe progressive life-limiting muscle-wasting condition. No curative therapy is currently available for Duchenne muscular dystrophy and therefore a novel approach is greatly needed.
    The main long-term aim of this study was to design a gRNA-guided Cas9 system that could be used to repair a deletion of exons 8-12 in the DMD gene by knocking in the missing exons. Specific aims for the MS thesis was to achieve myoconverted fibroblasts, analyze precise sequence of the DMD gene in a patient and to design gRNAs and a donor DNA template. Deletion breakpoints were located using both array comparative genomic hybridization and polymerase chain reaction (keðjufjölföldun) in combination with Sanger sequencing. Data from whole-genome sequencing of subject genome from DeCODE was used for comparison. The study subject was found to have a deletion of exons 8-12, corresponding to loss of roughly 196 kb. The gRNA-guided Cas9 system was successfully designed and expression vectors chosen. The cDNA for exons 8-12 was found to be 833 nucleotides and a donor DNA repair construct was designed. Immortalized myoconverted fibroblasts were derived from the subject in collaboration with the AFM-myobank, which were then expanded. A blasticidin S killing curve was made and transfection efficiency of the cells was measured. The estimated transfection efficiency of the cell lineage was found to be about 5% and blasticidin S killing curve gave the toxic dose of 6 μg/ml.
    gRNA-guided Cas9 system shows great potential in genome editing. However, there are still many technical problems that need to be improved before gRNA-guided Cas9 HDR can be applied to repair faulty gene in the clinic. The gRNA-guide Cas9 system from this study could be used in later research in restoring a fully functional protein.

  • Með tilkomu gRNA-miðlaðs Cas9 endónúklasa kerfis orðið bylting í erfðatækni þar sem hægt er að breyta og bæta erfðamengið með einfaldari hætti og meiri sértækni en annarri erfðatækni. Sýnt hefur verið fram á að með útgáfu af kerfinu aðlagaðri að heilkjarna frumum er hægt skjóta nýju geni með sértækum skurði og með því að ræsa samstæðubeindri endurröðun (i.e. homology directed repair). Sama aðferð hefur verið notuð til að lagfæra brottfall innan DMD gensins, sem veldur Duchenne vöðvarýrnun. Breytingar í DMD geni valda Duchenne vöðvarýrnun með alvarlegri vöðvarýrnun og styttan lífaldur. Enging lækning er þekkt og því er mikil þörf fyrir nýrri aðferð.
    Langtímamarkmið þessa verkefnis var að hanna gRNA-miðlað Cas9 kerfi sem hægt væri að nota til að laga brottfall á útröðum 8-12 í DMD geni með því að slá inn þeim útröðum sem vantar. Sérstök markmið þessa MS verkefnis var að koma upp vöðvalíkri-fíbróblasta frumulínu (e. myoconverted fibroblasts), greina nákvæma DNA-röð DMD gensins í viðfangsefni með sjúkdóminn, hanna gRNA þræði og hanna DNA gjafaniðmát (e. donor template). Brotstaðirbrottfallsins voru fundnir með örflögugreiningu (e. array comparative genomic hybridization) og keðjufjölföldun (e. polymerase chain reaction (PCR)) með Sanger raðgreiningu. Gögn úr raðgreiningu á heildarerfðamengi (e. whole-genome sequencing) viðfangefnisins hj´á deCODE voru notuð til samanburðar. Brottfallið í viðfangsefninu náði yfir rúmlega196 kb. gRNA-miðlaða Cas9 kerfið var hannað og tjáningsferjur (e. expression vectors) valdar. cDNA röðin fyrir útraðir 8-12 var 833 núkleótíð og DNA gjafa sniðmátið var hannað. Í samvinnu við AFM-myobank í Frakklandi voru ódauðlegir vöðvalíkir fíbróblastar búnir til úr frumum viðvangsefnisins og þeir voru svo ræktaðir. Blasticidin S drápsgraf (e. killing curve) var gerð fyrir frumulínuna og reyndist eiturskammtur 3μg/ml. Skilvirkni innleiðslu (e. transfection efficiency) mæld. Skilvirkni innleiðslun var um 5%
    Hægt væri að nota gRNA-miðlaða Cas9 kerfið úr þessari rannsókn í seinni rannsóknum á endurmyndun próteins með fulla virkni. gRNA-miðlaða Cas9 kerfið sýnir mikla möguleika sem erfðatækni. Samt sem áður eru mörg tæknileg vandamál sem þarf að komast yfir áður en hægt er að nota kerfið í klíník.

Samþykkt: 
  • 3.5.2016
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/24090


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Correction of Dystrophin gene with Homologous Directed Repair - Meistararitgerð.pdf15.18 MBLokaður til...01.01.2020HeildartextiPDF
Guðjón Reykdal.pdf23.42 kBLokaðurYfirlýsingPDF