Extrinsic and intrinsic regulation of breast epithelial plasticity and survival

Abstract

Branching morphogenesis in the mammary gland is controlled by intrinsic factors and extrinsic signals from the microenvironment, including factors released from the vascular-rich stroma. Epithelial to mesenchymal transition (EMT) and its reversed process mesenchymal to epithelial transition (MET) are believed to promote cellular plasticity which plays a major role in metastasis and therapy resistance, in particular through increased mobility of cells and resistance to anoikis. The aim of my study was to explore the extrinsic and intrinsic regulation of EMT-MET processes in 3D culture using the breast progenitor cell line D492 cocultured with endothelial cells and its mesenchymal-derivative D492M. I also wanted to explore the difference between these cell lines in terms of anoikis a special form of programmed cell death, as resistance to anoikis may be vital step in the EMT process.I have shown that endothelial cells promote branching and induce EMT in D492 in 3D culture. An EMT subline, D492M shows drastic differences in non-coding RNA expression compared to D492. The most profound changes were downregulation of miR-200C-141 and upregulation of noncoding RNAs on the DLK1-DiO3 locus, including the lncRNA MEG3. Ectopic expression of miR-200C-141 in D492M induced MET, however, only the luminal epithelial phenotype was seen. Co-expression of miR-200c-141 and the myoepithelial transcription factor ∆Np63 in D492M restored the branching morphogenesis in 3D culture. Overexpression of miR-200C-141 in D492 and D492M inhibited endothelial induced EMT. Additionally, I identified MEG3 as a stromal marker and an independent marker for poor prognosis in breast cancer. Finally, I showed that treatment of the D492 and D492M with a specific PTP1B inhibitor induced anoikis with D492M being more sensitive to PTP1B inhibition. I also provide evidence that inhibiting PTP1B affects the expression of cell adhesion proteins and actin polymerization. Collectively, my data indicates that extracellular signals from endothelial cells can have profound effect on epithelial phenotype and I have identified noncoding RNAs both upregulated and downregulated as a response to those signals. Finally I show that through adhesion complexes PTP1B could be an important regulator of anoikis in breast epithelial cells.

Myndun greinóttrar formgerðar í brjóstkirtli er stjórnað af innan- og utanfrumu boðum, meðal annars boðefnum sem seytt er frá frumum í nærumhverfi kirtilsins. Bandvefsumbreyting þekjufrumna (e. epithelial to mesenchymal transition, EMT) og viðsnúningur á því ferli, þekjufrumuumbreyting bandvefsfruma (e. mesenchymal to epithelial transition, MET) eru ferlar sem taldir ýta undir sveigjanleika í svipgerð frumna og leika stórt hlutverk í myndun meinvarpa og lyfjaónæmi krabbameinsfrumna, sérstaklega þar sem EMT eykur frumuskrið og þol/viðnám gegn anoikis, stýrðum frumudauða sem framkallast þegar fruma missir tengsl við millifrumuefnið.Markmið þessa verkefnið var að rannsaka stjórnun innan- og utanfrumu boða á EMT-MET ferlinu í þrívvíðri rækt. D492 frumulínan var notuð í samrækt með æðaþeli sem og dótturfrumulína hennar, D492M (EMT frumulína). Einnig var markmiðið að skoða nænmi þessara frumulína við hindrun á PTP1B fosfatasanum, með tilliti til anoikis, þar sem viðnám við anoikis er eitt af lykil þáttum EMT ferlisins.Í samrækt með D492 að þá örvuðu æðaþelsfrumur myndun greinóttrar formgerðar og EMT-umbreytingu D492 fruma. Tjáning á ncRNAs í bandvefslíku dótturfrumulínunni D492M var mjög frábrugðin D492 móðurlínunni. Mestur var munurinn á niðurslætti miR-200 fjölskyldunnar og aukin tjáning á ncRNAs (ókóðandi-RNA) á DLK1-DIO3 lókusnum, þar á meðal á MEG3. Yfirtjáning á miR-200c-141 í D492M olli MET, og stýrði frumum í átt að sérhæfingu kirtilþekjufruma. Við yfirtjáningu á miR-200c-141 og og umritunarþættinum ∆Np63 í D492M endurheimti frumulínan eiginleikann til að mynda greinótta formgerði í 3D rækt. Yfirtjáning á miR-200c-141 í D492 og D492M hindraði EMT. MEG3 tjáning eykst við bandvefsumbreytingu D492 og er meira tjáð í bandvefsfrumum brjóstkirtilsins. MEG3 tjáning var tengd skertri lifun brjóstakrabbameinssjúklinga. Rannsóknir á hindrun PTP1B með lyfjahindra sýndi stýrðan frumudauða í D492, með svipgerð anoikis. D492M er næmari fyrir PTP1B hindrun en D492 Og PTP1B hindrun dregur einnig úr tjáningu viðloðunarpróteina í D492 og truflar fjölliðun actins stoðgrindarpróteina. Samantekið var sýnt fram á að utanfrumuboð frá æðaþelsfrumum geta haft mikil áhrif á vöxt og formgerð þekjuvefjar brjóstkirtilsins, þ.m.t. EMT. Ég fann ncRNAs sem eru breyta tjáningu við áhrif æðaþelsfrumna. Ég sýni jafnframt fram á að PTP1B virðist hafa áhrif á lifun frumna gegnum frumu-frumu tengsl.