The role of MITF in autophagy regulation in melanoma

Abstract

Eitt af mikilvægustu innanfrumuferlunum fyrir heilbrigða og eðlilega starfsemi frumunnar er niðurbrotsferlið sjálfsát. Sjálfsát er m.a. talið vera mikilvægt til að sporna gegn myndun krabbameina. Hins vegar getur sjálfsát einnig hvatað lifun krabbameinsfruma með því að bregðast við áreiti, (t.d. súrefnisþurrð sem er algeng í umhverfi krabbameina) og aukið lífsmöguleika fruma. Því er sjálfsát álitið fýsilegt skotmark í lyfjaþróun gegn krabbameinum, meðal annars sortuæxlum. Umritunarþættirnir TFEB og TFE3 stjórna sjálfsátsferlinu í hinum ýmsu frumugerðum. Þeir bregðast við ýmsu áreiti og hafa áhrif á tjáningu gena sem koma við sögu í sjálfsátsferlinu. Umritunarþátturinn MITF, sem er náskyldur TFEB og TFE3, er lykilstjórnprótein í þroskun og lifun litfruma og stjórnar framleiðslu melaníns, efnisins sem stjórnar lit húðar og hárs. MITF er einnig talið vera lykilþáttur í þróun sortuæxla. Vegna skyldleika MITF og TFE umritunarþáttanna er mikilvægt að greina hvort MITF gegni einnig hlutverki við stjórnun sjálfsáts- og leysikornagena.Greining á genatjáningu í 23 sortuæxlis-frumulínum sýndi að tjáning MITF hefur fylgni við tjáningu leysikorna- og sjálfsátsgena. Ónæmisfelling á MITF í sortuæxlislínunni 501Mel sýndi að MITF getur bundist stýrlum ákveðinna leysikorna- og sjálfsátsgena. Yfirtjáning á MITF í 501Mel frumum leiddi til aukinnar tjáningar á nokkrum leysikorna- og sjálfsátsgenum og til aukinnar myndunnar á sjálfsátsbólum, en hafði ekki áhrif á heildarniðurbrotsferlið. Með notkun CRISPR/Cas9 aðferðarinnar var MITF fellt út í sortuæxlisfrumulínunni SkMel28. Þessar frumur sýndu aukna tjáningu á leysikorna- og sjálfsátsgenum og aukið niðurbrot í gegnum sjálfsát, bæði við venjuleg ræktunarskilyrði og sem svar við svelti. Bæði yfirtjáning og brottfelling á MITF sýndu að MITF stjórnar tjáningu á TFE3 á neikvæðan hátt en tjáningu TFEB á jákvæðan hátt í þessum frumum. Með notkun siRNA var TFE3 tjáning minnkuð og sýndu þær tilraunir að TFE3 gæti verið lykilþáttur í stjórnun á sjálfsátinu í frumunum sem tjá ekki MITF. Sjálfsátsferlið er mjög virkt í sortuæxlum og hefur verið tengt lyfjaþoli í krabbameinsmeðferðum. Í þessari rannsókn sýnum við að MITF kemur við sögu í stjórnun á tjáningu gena sem eru mikilvæg fyrir sjálfsátsferlið og að MITF hefur áhrif á niðurbrot í gegnum sjálfsát. Einnig sýnum við að TFEB og TFE3 taka þátt í stjórnun sjálfsáts í sortuæxlisfrumum. Í ljósi þess að bæði MITF og sjálfsát eru talin álitleg lyfjamörk í sortuæxlum, teljum við mikilvægt að skilgreina samband þessarra tveggja þátta betur og hafa það í huga við lyfjaþróun.

Autophagy is an intracellular degradation pathway that is important for cellular clearance and health, and is believed to be tumour preventive. However, autophagy can also act in a tumour promotive way by increasing tumour cell survival under stress conditions, such as hypoxia, that are common in the tumour microenvironment. Autophagy is therefore considered a therapeutic target in various cancer types, including melanoma. The transcription factors TFEB and TFE3 have been shown to play a key role in autophagy regulation in various cell types by responding to various stressors and affecting gene expression required for this process. A close relative of these factors is the transcription factor MITF, the master regulator of melanocyte development and melanoma. This thesis investigates if, like the TFE factors, MITF is involved in regulating autophagy and lysosomal biogenesis.Analysis of expression data from 23 melanoma cell lines showed that MITF expression correlates with lysosomal and autophagy gene expression. Chromatin immunoprecipitation experiments in 501Mel melanoma cells show MITF binding to promoters of autophagy and lysosomal genes. MITF overexpression in 501Mel cells lead to increased expression of certain autophagy and lysosomal genes and to increased numbers of autophagosomes, but did not affect autophagic flux. The SkMel28 melanoma cell line was used to generate MITF knock out cells using the CRISPR/Cas9 technique. These cell lines showed increased expression of autophagy and lysosomal genes and enhanced autophagic flux, both at basal levels and in response to starvation. In summary, overexpression and knockout experiments revealed that MITF regulates the expression of TFE3 in a negative manner and TFEB in a positive manner. TFE3 knockdown experiments suggest that TFE3 might be a key player in autophagy regulation in the MITF knockout cellsAutophagy is high in melanoma and has been linked to tolerance against cancer treatment. In this study, we have found that MITF affects autophagy gene expression and autophagic activity in melanoma cell lines, and that TFE3 and TFEB are also involved in autophagy regulation in these cells. In light of both MITF and autophagy being considered a therapeutic target in melanoma, we believe that this relationship needs to be defined in more detail and taken into consideration.