Sameindaerfðafræðileg skimun á RhD blóðflokki fósturs: Aðferðaþróun

Abstract

Inngangur: Fóstur- og nýburablóðrof (FNB) er sjúkdómur sem felur í sér mótefnamyndun hjá barnshafandi konu, sem veldur rauðkornarofi hjá fóstri. Hjá nýburum kemur sjúkdómurinn fram sem gula, sem oftast er væg og meðhöndluð með ljósameðferð. Alvarlegri tilvik einkennast af miklu blóðleysi og háum styrk bilirúbíns í blóði, sem getur leitt til kjarnagulu. Rhesusvarnir hófust árið 1969 á Íslandi. Þær eru fyrirbyggjandi aðgerðir til að koma í veg fyrir næmingu og RhD mótefnamyndun hjá RhD neikvæðum mæðrum. Næming getur átt sér stað á meðgöngu en það gerist við blóðblöndun fósturs og móður. Blóðblöndun á sér stað í um 7% meðgangna. Eftir að Rhesusvarnir hófust hefur tilfellum FNB fækkað talsvert. Næming á sér stað í um 1-2% tilvika þegar móðir er RhD neikvæð og fóstur RhD jákvætt. Áður en Rhesusvarnir hófust var þetta hlutfall um 13%. Í mörgum löndum er RhD neikvæðum konum gefin anti-D mótefnasprauta á seinasta þriðjungi á meðgöngu. Talið er að slíkar fyrirbyggjandi aðgerðir lækki algengi RhD næmingar niður í 0,2-0,3%. Markmið þessa verkefnis er að taka þátt í aðferðaþróun fyrir sameindaerfðafræðilega greiningu RhD blóðflokks fósturs. Eftir fullgildingu aðferðar mun niðurstaða greiningarinnar vera lögð til grundvallar ákvörðunar um fyrirbyggjandi anti-D ónæmisglóbúlínmeðferð móður.Efni og aðferðir: Plasma úr heilbrigðum blóðgjöfum og plasma úr meðgöngusýnum var notað í aðferðaþróun. Gerð var prófun á þremur aðferðum til að einangra cfDNA úr plasma. Prófaðar voru tvær PCR aðferðir, önnur var aðkeypt tilbúin aðferð og hin var heimatilbúin. Mest var unnið með vísapör til mögnunar á útröð 5 RHD gensins og GAPDH gensins, til viðmiðunar. Tækið sem notað var til rauntíma kjarnsýrumögnungar heitir C1000 Touch Thermal Cycler og forritið sem notað var við skoðun á niðurstöðum heitir Bio-Rad CFX Manager. Niðurstöður: Einangrunar aðferð Qiagen kom best út úr samanburði þriggja aðferða. Mælanlegt magn cfDNA var einangrað úr plasma heilbrigðra blóðgjafa og úr óléttum konum. Gerður var samanburður á tveimur PCR aðferðum og mögnun á cfDNA úr blóðgjöfum og meðgöngusýnum heppnaðist með báðum aðferðum. Greining á RhD blóðflokki fósturs heppnaðist með báðum aðferðum. Umræður: Munurinn á PCR aðferðunum er sá að önnur þeirra er sértækari með minni mögnun (TGM aðferð) og hin er næmari með sterkari mögnun (RP aðferð). Næstu skref í aðferðaþróuninni er að reyna að auka styrk cfDNA við einangrun, auka sértækni RP aðferðar og reyna að fá sterkari mögnun með TGM aðferð, ákvarða á hvaða viku meðgöngu heppilegast er að greina RhD blóðflokk fósturs og prófa önnur vísapör til mögnunar á öðrum útröðum RHD gensins samhliða útröð 5.