Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: https://hdl.handle.net/1946/24791
Ensím eru prótein er virka sem hvatar fyrir hina ýmsu líffræðilegu ferla frumunnar. Í sínu virka formi eru þessi prótein gjarnan samsett af nokkrum undireiningum sem saman vinna verk ensímsins. Alkalískur fosfatasi úr kuldakæru Vibrio splendidus sjávarbakteríunni (VAP er tvíliða, þ.e. samsett úr tveimur eins undireiningum. Í verkefninu sem hér er lýst var unnið með tvö villigerðarafbriði af þessu ensími, annars vegar Strep-tag merkt en hins vegar 2x FLAG-tag merkt afbrigði. Í báðum tilfellum var ensímið lengt frá karboxýlenda með stuttri röð amínósýra til að auðvelda rannsóknir á samskiptum eininganna tveggja og jafnvægisástandinu þeirra á milli.
Verkefnið beindist að mestum hluta að því að hanna röð aðgerða til einangrunar á 2x FLAG afbrigðinu eftir tjáningu þess í örveru, sem og að finna leið til að fylgjast með mögulegum undireiningaskiptum þess við Strep-tag afbrigðið.
Hentug aðferð var þróuð fyrir hreinsun á 2x FLAG afbriðinu, en jafnframt komið auga á skref sem bæta má. Rannsóknin á samskiptum eininganna fól í sér að meta nokkrar aðferðir við að greina einliður frá tvíliðum, og tvíliður sem voru búnar að aðgreinast í einliður og endurparast aftur við nágranna. Auk notkunar á Strep-tag spunasúlum, voru til athugunar aðferðir til skoðunar á á undireiningaskiptum sem fólust annars vegar í rafdrætti (með eða án urea, eða "Coomassie Blue") en hins vegar jónaskiptaskiljun. Báðar aðferðirnar lofa góðu um að greina megi blending af Strep-tag og FLAG-tag merktum VAP undireiningum á hraðan og auðveldan hátt.
Enzymes are proteins which act as catalysts for cellular biological processes. Enzymes are often composed of a few, or more subunits in their active form. Alkaline phosphatase from the cold-adapted Vibrio splendidus marine bacteria is a homodimer, i.e. it is composed of two identical monomers. In this project, two wild-type variants of the Vibrio alkaline phosphatase were used, one with a Strep-tag on it C-terminus, coupled with a 2-amino acid linker, and another variant with a 2x FLAG tag on its C-terminus. These tags are intended to simplify research based on the interaction of these variants and their subunits, as well as the equilibrium between the two.
The main objective of the project can be thought of as being twofold. First it was to design a purification protocol for the 2x FLAG variant (after expression in bacteria), and secondly to find a way to monitor the possible subunit exchanges between the two variants.
A simple and convenient protocol was developed for the purification of the 2x FLAG variant, but some elements of said protocol could be improved upon further. Regarding the subunit exchanges, a number of methods were tried and assessed on their ability to distinguish between monomers and dimers, as well as identifying dimers with had possibly unfolded into monomers and paired up with nearby monomers. Strep-tag spin columns, along with various electrophoresis techniques (with and without urea, or Coomassie Blue dye), and ion exchange chromatography were used for this purpose. Both electrophoresis and ion exchange techniques proved promising to be able to observe a hybrid of Strep-tag and 2x FLAG tagged variants, most notably urea gel electrophoresis and QFF ion-exchange chromatography.
Skráarnafn | Stærð | Aðgangur | Lýsing | Skráartegund | |
---|---|---|---|---|---|
Ólafur Ármann - Characterization of FLAG-tagged Vibrio alkaline phosphatase.pdf | 3,88 MB | Opinn | Heildartexti | Skoða/Opna | |
Ólafur+Ármann+Sigurðsson+-+Yfirlýsing+$0028Skemman$0029.pdf | 23,39 kB | Lokaður | Yfirlýsing |