Development of highly sensitive LC-ESI MS/MS method for neurotransmitters and MALDI imaging analysis on β-N-methylamino-L-alanine (BMAA) neurotoxin

Abstract

Development of highly sensitive LC-ESI MS/MS method and MALDI imaging analysis on β-N-methylamino-L-alanine (BMAA) neurotoxinBackground: Neurotransmitters (NTs) are important as chemical messengers such as transmitting signaling between neuronal cells. Their fluctuations are associated with neurological diseases such as Parkinson’s disease. Cyanobacterial neurotoxin known as β-N-methylamino-L-alanine (BMAA) is considered to play a role in neurodegenerative diseases including Parkinson’s disease. It is essential to be able to detect NTs abnormalities with accurate and reliable methods for a better insight to the pathological process investigated.Objectives: Highly sensitive liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry (LC-ESI MS/MS) was developed for multiple neurotransmitters, precursors and metabolites both with and without derivatization agents. A recently developed method based on a specific molecular derivatization approach, i.e., matrix-assisted laser desorption/ionization imaging (MALDI-MSI) was used in this project for imaging of BMAA neurotoxin.Methods: Evaluation and optimization for the method development involved finding the suitable columns, mobile phases compositions and gradients for LC-ESI MS/MS analysis of small molecule NTs. A derivatization reagent step was used for the most critical NTs in order to increase the sensitivity of the LC-ESI MS/MS method. Tissue extractions from striatum of male Wistar rats in three different concentrations were spotted on a specific MALDI plate.Results: It remained challenging for dopamine (DA), serotonin (5-HT) and their metabolites and precursors to be separated using a reversed phase liquid chromatography (RPLC) column. By implementing hydrophilic interaction chromatography (HILIC) column an enhancement in sensitivity was achieved. A derivatization step increased the sensitivity of the NTs dramatically and addition of triethylamine (TEA) to the solution improved it even more. Finally, BMAA neurotoxin showed to be dose dependent following derivatization in MALDI MSI. Conclusion: The presented results suggested that NTs following derivatization indicated an essential step in sensitivity for the polar small molecule NTs investigated.

Þróun á hánæmri LC-ESI MS/MS aðferð fyrir taugaboðefni ásamt myndgreiningu á β-N-metýlamínó-L-alanín (BMAA) taugaeitri með MALDI massagreiniBakgrunnur: Taugaboðefni eru mikilvæg fyrir flutning boða á milli taugafrumna. Sveiflur í styrk taugaboðefna tengjast taugasjúkdómum eins og m.a. Parkinsons sjúkdómi. Cyanobakteríu taugaeitur, þekkt sem β-N-metýlamínó-L-alanín (BMAA) er talið gegna hlutverki í taugahrörnunarsjúkdómum, þar með talið Parkinsonsveiki. Nauðsynlegt er að geta greint óeðlileg taugaboðefni með nákvæmum og áreiðanlegum aðferðum til að öðlast betri innsýn í það sjúkdómsferli sem rannsakað er. Markmið: Mjög næm LC-ESI MS/MS aðferð var þróuð fyrir helstu taugaboðefni, forefni og umbrotsefni bæði með og án afleiðumyndun. Nýlega þróuð aðferð byggð á sérstakri sameinda afleiðu aðferð, þ.e. MALDI-MSI var notuð í þessu verkefni fyrir myndgreiningu á BMAA taugaeitri.Aðferðir: Aðferðafræðin var metin og hámörkuð með því að finna hentugar súlur, ferðafasa og stigul ferðafasans fyrir LC-ESI MS/MS greiningu á smásameinda taugaboðefnum. Afleiðu skref var notað fyrir mikilvægustu taugaboðefnin til að auka næmni LC-ESI MS/MS aðferðinnar. Vefjaútdráttur frá rákakjarna (striatum) heila af karlkyns Wistar rottum í þremur mismunandi styrkleikum var sett á sérstaka MALDI plötu. Niðurstöður: Það reyndist krefjandi fyrir dópamín, serótónín ásamt umbrotsefnum og forverum þeirra að aðskiljast með vökvaskiljunarsúlu með óskautuðum stöðufasa í LC-ESI MS/MS (e. RPLC). Með innleiðingu á vökvaskiljunarsúlu sem byggist á vatnssækinni víxlverkun (e. HILIC) náðust miklar framfarir í næmni. Afleiðuskref jók næmni taugaboðefna verulega og með viðbót tríetýlamín í lausnina jókst hún enn meira. Að lokum virtist BMAA taugaeitur vera skammtaháð þegar afleiðuskref var notað í MALDI-MSI.Ályktanir: Niðurstöður bentu til þess að afleiðuskref var nauðsynlegt til þess að auka næmni fyrir skautaðar litlar taugaboðasameindir.