Sample Preparation Strategies for Breast Cancer Studies: Focus on Alpha-1-Acid Glycoprotein by means of MALDI-TOF mass spectrometry

Abstract

Sample preparation strategies for breast cancer studies: Focus on α-1-acid glycoprotein by means of MALDI-TOF mass spectrometry.Background: Breast cancer is a heterogeneous disease that applies to more than 10% of women in the Western world with increasing incidence rate. Current preventive treatments of women carrying high risk hereditary mutations for breast cancer involve risk-reducing bilateral mastectomy (RRBM), a highly invasive procedure. Investigating and evaluating potential breast cancer biomarkers from human serum with the use of mass spectrometry could potentially serve as a non-invasive early detection method for breast cancer patients.Objective: A sample preparation method was developed to measure and evaluate α-1-acid glycoprotein from human serum as a potential breast cancer biomarker using a MALDI-TOF mass spectrometer. Additionally, an alternative digestion method was investigated in order to get additional data not otherwise obtained.Methods: α-1-acid glycoprotein was captured with AGP CaptureSelect beads using immunoprecipitation. A bottom-up proteomic workflow was performed in-solution as samples were reduced, alkylated and digested with trypsin. A second capture was carried out to potentially explain the beads’ low binding capacity. Samples were desalted and analysed using a MALDI-TOF mass spectrometer. In order to implement an Arg-C like digestion, a reaction using propionic anhydride was explored, as recently published.Results: A successful sample preparation method was developed for the isolation of α-1-acid glycoprotein. It was shown that both isoforms were isolated using the available antibody containing beads. The low binding capacity of these beads could not be explained by the hypothesis that only one specific glycoform was bound as the results of the so-called second capture argued against this. Whether implementing an Arg-C like digestion would facilitate the analysis of α-1-acid glycoprotein was inconclusive as the propionic anhydride reaction was unsuccessful.Conclusion: Although a sample preparation method for the capturing of α-1-acid glycoprotein was successfully developed, further studies regarding the capturing of AGP using AGP CaptureSelect beads are required. Therefore, we conclude that these beads are not ideal for the capturing α-1-acid glycoprotein and that further studies are required to implement α-1-acid glycoprotein as a biomarker for early breast cancer diagnosis.

Sýnaundirbúningur fyrir brjóstakrabbameinsrannsóknir: Áhersla á α-1-sýru sykruprótín með MALDI-TOF massagreiningu.Bakgrunnur: Brjóstakrabbamein er misleitur sjúkdómur með hækkandi nýgengi sem herjar á meira en 10% kvenna í hinum vestræna heimi. Núverandi fyrirbyggjandi meðferðir fyrir konur í áhættuhóp með arfgenga stökkbreytingu eru meðal annars fyrirbygjandi brjóstnám. Með því að rannsaka og meta mögulegar lífsameindir úr blóðvatni brjóstakrabbameinssjúklinga með massagreiningum, er möguleiki á að þróa hentugri greiningaraðferð á brjóstakrabbameini. Markmið: Markmið rannsóknarinnar var að þróa sýnameðhöndlunaraðferð til að greina og meta α-1-sýru sykruprótín í blóðvatni með MALDI-TOF massagreini sem mögulegan lífmark fyrir greiningu á brjóstakrabbameini. Að auki var niðurrofsaðferð þróuð til að bæta greiningu á prótíninu sem annars myndi ekki fást.Aðferðir: α-1-sýru glýkóprótein var einangrað með mótefnafellingu á AGP CaptureSelect kúlum. Með svo kölluðu „bottom-up” verkferli sem framkvæmd var í lausn, voru sýnin afoxuð, alkýleruð og klofin með trypsíni. Framkvæmd var önnur einangrunarlota til að mögulega útskýra litla bindigetu kúlanna. Sýnin voru hreinsuð og greind með MALDI-TOF massagreini. Til að framkvæma Arg-C líka niðurrofsaðferð var kannað hvort hægt væri að framkvæma efnahvarfið með própíónik anhýdríði, samkvæmt nýlegri birtingu.Niðurstöður: Þróun á sýnameðhöndlunaraðferð fyrir einangrun á α-1-sýru sykruprótíni reyndist árangursrík. Niðurstöður sýna að bæði ísóform próteinsins voru einangruð með notkun á tiltæka mótefninu sem tengt var við kúlurnar. Ástæða fyrir lágri bindigetu kúlanna var ekki hægt að útskýra með kenningunni um að einungis eitt glýkóform væri bundið kúlunum þar sem niðurstöður úr seinni einangrunarlotunni sýndu annað. Hvort það sé hagstætt að framkvæma Arg-C líka niðurrofsaðferð er ekki vitað þar sem própíóník anhýdríð hvarfið misheppnaðist.Ályktanir: Þrátt fyrir að sýnameðhöndlunaraðferðin fyrir einangrun á α-1-sýru sykruprótíni reyndist árangurrík er þörf á frekari þróun á aðferðinni fyrir notkun AGP CaptureSelect kúlanna til að einangra prótínið. Því ályktum við að þessar tilteknu kúlur eru ekki hentugar fyrir einangrun á α-1-sýru sykruprótíninu og framkvæma þurfi fleiri rannsóknir til að hægt sé að nota prótínið sem lífmark fyrir greiningu brjóstakrabbameina.