Macrolide resistant Streptococcus pyogenes in Iceland. Epidemiological and molecular study

Abstract

Streptococcus pyogenes (group A streptococcus, GAS) is an important cause of morbidity and mortality in humans worldwide. Penicillin is the standard of care for treating GAS infections and all GAS strains are susceptible to penicillins, but macrolides are the secondary line of treatment for individuals allergic to penicillins. Resistance to antibiotics, primarily macrolides (e.g. erythromycin), is an increasing concern in the treatment of GAS infections. The first two macrolide resistant GAS epidemics in Iceland have been investigated with pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The results suggested that the macrolide resistant isolates were highly clonal populations which sparked an interest to whole-genome sequence all macrolide resistant GAS isolates available at the Department of Microbiology at the Landspítali University Hospital of Iceland. The main aims of this study were to investigate epidemiology of macrolide resistant isolates with emphasis on relation to specific clones and investigate genetic relationship among the resistant isolates, the mechanism that causes macrolide resistance in GAS in Iceland and the expression of the most prevalent genes that encode for macrolide resistance in the isolates.Laboratory information system at the Department of Microbiology at the Landspítali University Hospital of Iceland was used to get the data needed. Only patient samples were used. Erythromycin resistant GAS that had been identified and stored at the Department of Microbiology at the Landspítali University Hospital of Iceland from the years 1998-2016 were sent to Houston Methodist Research Institute for whole-genome sequencing in Illumina NextSeq500 sequencer. Gene expression analysis of the most prevalent macrolide resistance genes found among the GAS population, was performed for 15 isolates, 5 from each emm-type with quantitate real time PCR (qRT-PCR). Gene expression of the most prevalent macrolide resistance genes, with erythromycin induction was performed for 4 isolates. To see if MICs for the 15 isolates, increased post erythromycin induction, E-test were performed.Whole-genome sequencing for the 1,515 macrolide resistant GAS isolates revealed that 90.3% isolates belonged to three emm-types, emm4 (n=713), emm6 (n=324) and emm12 (n=332). Out of the three most prevalent emm-types, 99.3% carried the macrolide resistant genes, mefA and msrD. In total, three macrolide resistant GAS epidemics have occurred in Iceland and each emm-type is the main cause of each epidemic. Isolates within an emm-type are a highly clonal population. mefA and msrD sequences and the upstream region of mefA-msrD between emm-types are relatively invariant. Differences in mefA and msrD expression levels between emm4 and emm6 isolates were modest but emm12 isolates expressed significantly more of mefA and msrD compared to emm4 and emm6 isolates. All four isolates tested showed increased mefA and msrD expression levels when induced with erythromycin. MICs for the 15 isolates increased post erythromycin induction.The results confirmed that each emm-type is a highly clonal population. Also, each epidemic was due to a single clone which shows the importance of surveillance of macrolide resistance, because macrolide consumption is not the only factor concerning prevalence in macrolide resistance.

Streptococcus pyogenes (group A streptococcus, GAS) er mikilvægur sýkingavaldur í mönnum og alvarlegar sýkingar af völdum bakteríunnar hafa háa dánartíðni. Penisillín er kjörlyf gegn GAS og allir GAS stofnar eru næmir fyrir sýklalyfinu. Ef einstaklingar eru með ofnæmi fyrir penisillín eru makrólíðar notaðir (t.d. erythromycin) sem meðferð gegn GAS sýkingum. Makrólíðónæmi er vaxandi áhyggjuefni þegar kemur að meðferð GAS sýkinga. Fyrstu tveir makrólíð ónæmir GAS faraldrar á Íslandi hafa verið rannsakaðir með PFGE (e. pulsed field gel electrophoresis) og leiddu niðurstöður í ljós að stofnarnir eru að öllum líkindum mjög erfðafræðilega skyldir. Þar með varð áhugi fyrir því að heilraðgreina alla makrólíð ónæma GAS stofna sem til eru í stofnasafni sýklafræðideildar LSH, í þeim tilgangi að staðfesta niðurstöður úr PFGE. Í PFGE rannsókninni var auk þess aðeins valið ákveðið úrtak af stofnum. Meginmarkmið rannsóknarinnar var að kanna faraldsfræði makrólíð ónæmu GAS stofnanna í tengslum við einstaka klóna, kanna erfðafræðilega skyldleika meðal stofnanna, hvað veldur makrólíðónæmi í GAS á Íslandi og tjáningu á algengustu genum sem tjá fyrir makrólíð ónæminu.Notast var við upplýsingar úr tölvukerfum sýklafræðideildar LSH og voru aðeins sjúklingasýni notuð. Erythromycin ónæmir GAS stofnar sem höfðu verið greindir og geymdir á Sýklafræðideild LSH á árunum 1998-2016 voru sendir til Houston Methodist Research Institute (Houston, Texas), þar sem þeir voru heilraðgreindir í Illumina NextSeq tæki. Genatjáning á makrólíð ónæmis genum sem finnast helst meðal íslensku makrólíð ónæmu GAS stofnanna, var rannsökuð hjá 15 stofnum með qRT-PCR (e. quantitate real time PCR), fimm stofnum af hverri emm-týpu. Genatjáning á þessum genum eftir að stofnarnir voru útsettir fyrir erythromycin var skoðuð í fjórum stofnum. MIC (e. minimum inhibitory concentration) fyrir erythromycin var kannað hjá 15 stofnunum með E-test til að athuga hvort MIC gildin hækki eftir erythromycin útsetningu.Af 1515 raðgreindum stofnum voru 90,3% af þrem emm-týpum, emm4 (n=713), emm6 (n=324) og emm12 (n=332). Af þeim báru 99,3% makrólíð ónæmis genin mefA og msrD. Það hafa orðið þrír GAS faraldar af völdum makrólíð ónæmra stofna á Íslandi og hver emm-týpa er helsta orsök hvers faraldurs. Stofnar hverrar emm-týpu voru mjög skyldir innbyrðis. Raðir fyrir mefA, msrD og stýril ofanvert við mefA-msrD voru nánast óbreyttar meðal GAS stofnanna. Tjáning mefA og msrD var svipuð meðal emm4 og emm6 stofna en emm12 stofnar sýndu marktækt hærri tjáningu á genunum heldur en emm4 og emm6 stofnarnir. Allir fjórir stofnar sem prófaðir voru, sýndu hærri tjáningu á mefA og msrD eftir að stofnarnir voru útsettir fyrir erythromycin. Einnig sýndu stofnarnir aukin MIC gildi eftir að hafa verið útsettir fyrir erythromycin.Niðurstöður rannsóknarinnar staðfestu að um sé að ræða mjög erfðafræðilega skylda stofna innan hverra emm-týpu. Einnig að hver faraldur sé af völdum ákveðins klóns. Það ýtir enn meir undir mikilvægi þess að fylgjast með makrólíð ónæmi í GAS þar sem tíðni sýklalyfja notkunar er ekki eini orsakavaldur á breytingu í tíðni ónæmisins.