Hlutverk V-ATPasa í sortuæxlum. Áhrif niðurfellingar undireininga V-ATPasa á sýrustig fruma

Abstract

Inngangur: Eitt af aðal einkennum illkynja krabbameina er lækkað sýrustig í nærumhverfi æxla, en það eykur frumufjölda, stuðlar að ífarandi vexti og myndun meinvarpa. Sýrustigi umhverfisins er að miklu leyti stjórnað af V-ATPösum en í krabbameinum verður gjarnan aukning á tjáningu þeirra í frumuhimnum. V-ATPasar eru vel varðveitt holensím sem er tjáð í öllum heilkjarnafrumum líkamans. Þeir eru samsettir úr 13 undireiningum sem skipt er upp í tvö virknisvæði, V0 og V1. Hið fyrrnefnda ,V0 svæðið, sér um flutning á róteindum yfir himnuna en V1 svæðið sér um vatnsrof á ATP. Undireiningar V0 eru 5 og eru tilgreindar með litlum stöfum (a, c, c’’, d og e). Undireining a er aðal skynjari sýrustigs innan frumunnar. Hún er til í 4 mismunandi ísóformum en þau eru talin ákvarða staðsetningu V- ATPasans innan frumunnar. Í ljósi þess að V-ATPasar spila svo stóran þátt í illkynja hegðun krabbameina hafa þeir þótt fýsilegt lyfjaskotmark, sérstaklega vegna þess að nú þegar eru til lyf sem hamla virkni þeirra. Mikilvægt er að komast að því hvaða áhrif það hefur að fella niður tjáningu þeirra í krabbameinsfrumum. Markmið þessarar rannsóknar var að fella niður tjáningu á mismunandi ísóform undireiningar a og athuga áhrif þess á sýrustig innan frumunnar.Efniviður og aðgerðir: Útbúnar voru stöðugar 501mel sortuæxlisfrumulínur sem tjáðu flúrmerkt ísóform undirieiningar a í V-ATPösum. Einnig voru búnar til genaferjur sem innihéldu miRNA svæði til niðurfellingar á þessum sömu V-ATPösum. Til þess að athuga virkni þeirra var miRNA genaferjunum komið fyrir í þessum flúrljómandi sortuæxlisfrumulínum og minnkun á flúrljómun skoðuð með western blot og lagsjá (e. Confocal microscope). Þá var þróuð aðferð til að mæla sýrustig innan frumunnar með flúrljómandi sameind til þess að ákvarða hvort niðurfelling á V-ATPösum gæti haft áhrif á það. Einnig var staðsetning a undireininganna skoðuð í lagsjá með samlitun V-ATPasa og próteina með þekkta innanfrumustaðsetningu.Niðurstöður: Ekki var hægt að ákvarða með óyggjandi hætti hvort miRNA-in gætu fellt niður tjáningu á V-ATPösum innan frumunnar. Enginn sjáanlegur munur var á tjáningu V-ATPasanna í lagsjánni í samanburði við frumur án miRNA og tjáning V-ATPasa próteina á Western blotti var ekki marktækt öðruvísi þegar þau voru felld niður í samanburði við viðmið. Mæling á sýrustigi var ekki markverð vegna lítils merkis frá flúrljómandi sameindinni og því var ekki hægt að ákvarða hvort niðurfelling á V- ATPösum með miRNA hefur áhrif á sýrustig innan fruma. Samlitun V-ATPasanna við prótein með þekkta staðsetningu leiddi í ljós að a2 ísóformið var helst staðsett á sein-innblöðrum og endurvinnslu innblöðrum, a3 ísóformið var helst staðsett í frymisnetinu og á frumuhimnunni og a4 ísóformið var helst staðsett í frymisneti, golgikerfinu, innblöðrum og á frumuhimnunni.Ályktanir: Þar sem ekki var hægt að draga ályktanir um áhrif niðurfellingar V-ATPasa með miRNA er mikilvægt að skoða það betur og notast við aðrar aðferðir til þess. Einnig væri hægt að þróa aðrar aðferðir við mælingar á sýrustigi innan frumu eða notast við nýrri sameindir til að athuga hvort betra merki næst. Samlitun leiddi í ljós að staðsetning V-ATPasans er að mörgu leyti sambærileg við það sem aðrar rannsóknir hafa sýnt með einhverjum undantekningum þó. Áhugaverð er tjáning a3 og a4 á frumuhimnunni en þær upplýsingar væri hægt að nota í meðferðarþróun gegn meinvarpandi sortuæxlum.