is Íslenska en English

Lokaverkefni (Meistara)

Háskóli Íslands > Heilbrigðisvísindasvið > Meistaraprófsritgerðir - Heilbrigðisvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/27674

Titill: 
  • Titill er á ensku Effect of thrombin and other PAR1 agonists on endothelium. Role of AMP-kinase and biased signaling.
  • Áhrif thrombins og annarra PAR1 áverkunarefna á æðaþel. Hlutverk AMP-kínasa og sveigðra boðleiða.
Námsstig: 
  • Meistara
Útdráttur: 
  • Útdráttur er á ensku

    Thrombin and activated protein C (APC) are well-established members of the blood coagulation cascade, thrombin being a key coagulation protease while APC, which is converted by thrombin from protein C, is an anti-coagulant. In addition to their coagulation-related effects, both thrombin and APC can mediate cell signaling through activation of PAR receptors.
    The interaction of thrombin and APC and its effect on endothelial activation and barrier hyperpermeability is complex. In short, thrombin causes activation of the endothelium, leading to expression of inflammatory cytokines, release of prothrombic molecules and increased leukocyte recruitment. In addition, it causes the endothelial barrier to disrupt, resulting in increased permeability. APC has been shown to inhibit the thrombin-induced effects through downregulation of proinflammatory cytokine expression and protection of the endothelial barrier. Interestingly, both thrombin and APC mediate their opposite effects through the same receptor, PAR1. This is called biased agonism, or biased signaling.
    The mechanism of APC’s action has been described before, but it is not completely understood and neither is thrombin’s. It is important to clearify the precise mechanism of APC’s and thrombin’s actions, especially since recombinant APC has been used as a drug treatment for patients with severe sepsis. Severe sepsis leads to widespread vascular permeability and one of APC’s proposed actions is endothelial barrier protection. Recombinant APC was withdrawn from the market because according to a repeat clinical trial, it did not reduce the mortality rate of patients.
    In this study, we determined the effects of the PAR activators APC and thrombin on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Phosphorylation and activation of proteins was determined by western blot analysis. Expression of cell adhesion molecules (CAMs) was detected with quantitative real-time PCR (qPCR) and western blots. Morphological changes in the actin cytoskeleton were ascertained with immunofluorescent staining. Endothelial barrier permeability was studied using di-phosphorylation of myosin light chain (MLC) and actin stress-fiber formation.
    Thrombin increased expression of CAMs, di-phosphorylation of MLC, actin stress-fiber formation activation of mitogen activated protein kinases (MAPKs) and decreased phosphorylation of AKT. This has already been established. When assessing APC’s effects on endothelial cells, it unexpectedly increased di-phosphorylation of MLC and decreased phosphorylation of AKT like thrombin did, and did not attenuate any of the thrombin-induced effects.
    According to the results in this study, APC does not display any anti-inflammatory effects nor barrier protective in cultured HUVEC monolayers. It does not reduce thrombin-induced inflammatory effects, but rather increases them. These results show previously undiscovered effects of APC and are in contrast with previous published studies from other groups. It appears that in cultured HUVEC monolayers, the biased agonism of PAR1 by thrombin and APC is not so unambiguous and further research is needed to understand the signaling mechanism in this model.

  • Thrombín og örvað prótein C (APC) eru þekktir þátttakendur í blóðstorknunarferli líkamans, þar sem thrombín er mikilvægur storkuþáttur en APC hamlar storkumyndun. Auk blóðstorknunarhlutverks þeirra geta bæði thrombín og APC miðlað frumuboðum með því að virkja PAR viðtaka.
    Samskipti thrombíns og APC og áhrif þeirra á virkjun og gegndræpi æðaþelsins eru flókin. Í stuttu máli veldur thrombín virkjun æðaþelsins, sem felur í sér tjáningu bólguboðefna, losun blóðstorkuþátta og aukna viðloðun hvítra blóðkorna í gegnum tjáningu viðloðunarsameinda. Auk þess veldur það auknu gegndræpi æðaþelsins. Sýnt hefur verið að APC geti komið í veg fyrir aukið gegndræpi og tjáningu bólguboðefna af völdum thrombíns. Áhuga vekur að þrátt fyrir andstæð áhrif þessara áverkunarefna valda bæði thrombín og APC áhrifum í gegnum sama viðtaka, þ.e. PAR1. Þetta er dæmi um fyrirkomulag sem kallast sveigð boðleið.
    Mikið hefur verið ritað um verkunarhátt APC, en hann er þó fjarri því að vera þekktur til fulls og það sama gildir um thrombín. Það er mikilvægt að greina nákvæma verkunarhætti bæði APC og thrombíns, sérstaklega í ljósi þess að APC (rhAPC) hefur verið notað sem lyf gegn alvarlegu sýklablæði (sepsis). Alvarlegt sýklablæði leiðir meðal annars til útbreidds gegndræpis æðaþelsins í æðakerfi líkamans og ein af verkunum APC er einmitt verndun æðaþelsins gegn auknu gegndræpi. Þrátt fyrir það var APC tekið af markaðnum eftir að klínísk rannsókn leiddi í ljós að það dró ekki úr dánartíðni sjúklinga með sýklablæði.
    Í þessari rannsókn könnuðum við verkunarhætti PAR1 virkjunar með APC og thrombíni og áhrif þeirra á æðaþelsfrumur úr bláæðum naflastrengja. Fosfórun próteina var ákvörðuð með mótefnaþrykki. Tjáning viðloðunarsameinda var ákvörðuð með qPCR og mótefnaþrykki. Lögunarbreytingar aktín-frymisgrindarinnar voru skoðaðar með flúrljómandi mótefnalitun. Gegndræpi æðaþelsins var metið með tvífosfórun á myosin light chain (MLC) og stressþráðamyndun aktíns.
    Thrombín jók tjáningu viðloðunarsameinda, tvífosfórun á MLC, stressþráðamyndun aktíns og virkjun mitogen activated protein (MAP) kínasa en minnkaði fosfórun á AKT. Þetta er í samræmi við áður birtar niðurstöður. Við mat á áhrifum APC kom í ljós, að líkt og thrombín, jók það tvífosfórun á MLC og minnkaði fosfórun á AKT. Auk þess hindraði það ekki nein áhrif thrombíns.
    Samkvæmt niðurstöðum þessarar rannsóknar sýnir APC ekki nein bólguhamlandi áhrif né verndandi áhrif á gegndræpi æðaþelsins í ræktuðum frumum úr bláæðum naflastrengja. Það hindrar ekki bólgumiðlandi áhrif thrombíns, heldur virðist auka þau. Þessar niðurstöður um áhrif APC eru i mótsögn við birtar rannsóknir. Svo virðist sem að í þessu ræktunarlíkani séu boðleiðir af völdum thrombíns og APC mjög líkar, gagnstætt því sem búist var við. Frekari rannsókna á boðleiðum í æðaþelsfrumum eftir örvun með thrombini og/eða APC er greinilega þörf til fyllri skilnings á mikilvægu meinalífeðlisfræðilegu fyrirbæri.

Samþykkt: 
  • 29.5.2017
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/27674


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
MS_ritgerð_STK_FINAL_LOKAUTGAFA.pdf3.26 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna
Yfirlysing_um_medferd_lokaverkefnis.jpg339.93 kBLokaðurYfirlýsingJPG