is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár) Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/27862

Titill: 
  • Titill er á ensku Assessment of dimer-monomer equilibrium of a cold-adapted alkaline phosphatase by urea gel electrophoresis and ion exchange chromatography
  • Jafnvægisástand milli tvíliðuforms og einliðuforms metið fyrir fosfatasa úr kaldsjávarörveru með urea-hlauprafdrætti og jónaskiptaskilju
Námsstig: 
  • Bakkalár
Efnisorð: 
Útdráttur: 
  • Útdráttur er á ensku

    A certain focus has been placed on enzymes working under extreme conditions in order to understand how they manage to function compared to enzymes working at milder, more viable, conditions. In this study, alkaline phosphatase from the cold-adapted marine bacterium Vibrio splendidus (VAP) was examined. The enzyme is a homodimer having two identical subunits. The interaction between the subunits is particularly interesting for that they appear to "talk" and take turns in binding the substrate, i.e. the enzyme is considered to be a half site reactivity enzyme.
    In this project, the installation of a transverse urea gradient electrophoresis method was introduced and used to examine the kinetics associated with the monomer-dimer exchange of the enzyme at both low and high urea concentration, i.e. in both precursor conditions for unfolding as well as in unfolding conditions. Two variants of the enzyme were used, namely StrepTag®-tagged VAP and 2x FLAG-tagged VAP due to an extra six negatively charged C-terminal residues on each monomer in the latter type. The hypothesis was that the strength of the subunit association is variable depending on the variant and that the dimer association also is dependent on how tightly the magnesium ion in the enzyme reaction site is bound. Various versions of urea gels were made and the condition for the electrophoreses was optimized throughout the experiments in attempt to achieve the most accurate analysis of the unfolding process of the enzyme as possible.
    The second hypothesis examined was the existence of a monomer-dimer equilibrium. To find out if such an equilibrium was dynamic under normal experimental conditions, ion exchange chromatography was performed on a mixture of the two aforementioned VAP variants that can be separated using a Q-Sepharose ion exchange column. The mixing of the variants and the possible formation of a hybrid enzyme would confirm the hypothesis that a monomer-dimer equilibrium exists. Such a hybrid enzyme (i.e. a StrepTag-FLAG dimer) would be separable from the non-hybrid enzyme variants on a Q-Sepharose ion exchange column. The results were promising and do not rule out the possibility of an equilibrium between the monomeric and dimeric form. However, further experiments are needed to verify it.

  • Áhugi hefur lengi beinst að ensímum sem starfa við jaðaraðstæður til að fá skilið hvernig starfsemi þeirra er háttað samanborið við önnur ensím sem starfa við mildari og lífvænlegri, aðstæður. Í þessari rannsókn er alkalískur fosfatasi úr kuldakæru sjávarörverunni Vibrio splendidus skoðaður (VAP), en hann er tvíliða sem samsett er úr tveimur eins undireiningum. Starfsemi undireininganna er einkar áhugaverð að því leyti að þær virðast "tala saman" og vinna á víxl (e. half of site reactivity).
    Í þessu verkefni var fengist við uppsetningu á ákveðinni rafdráttaraðferð sem innihélt þverlægan þvagefnis-stigul í hlaupi. Með henni var skoðuð sú hraðafræði sem tengist einliðu-tvíliðu jafnvægi (e. monomer-dimer exchange) ensímsins bæði við lága og háa urea styrki, þ.e. við undanfara aðstæður afmyndunar og við afmyndandi aðstæður. Unnið var með tvö afbrigði ensímsins, annars vegar Strep-Tag VAP og hins vegar 2x FLAG-tagged VAP. Tilgátan var sú að tengsl undireininganna séu missterk eftir því hvaða afbrigði eigi í hlut og að tengslin séu einnig háð því hversu fast magnesíumjónin í hvarfstöð ensímsins binst. FLAG-afbrigðið hefur sex neikvætt hlaðnar amínósýrur á C-enda hvorrar einliðu. Ýmsar útgáfur af urea hlaupum voru gerðar og rafdráttaraðstæðurnar voru þróaðar á meðan á rannsókninni stóð í þeim tilgangi að ná sem nákvæmastri mynd af afmyndunarferli ensímsins.
    Önnur tilgáta sem könnuð var, er sú að jafnvægi eigi sér stað á milli einliðanna og tvíliðanna. Til að kanna það var notast við jónaskiptaskiljun á afbrigðunum tveimur sem búið var að blanda saman í lausn og síðan aðgreint á Q-Sepharósa skilju. Blöndun þeirra og hugsanleg myndun hýbríð afbrigðis (þ.e. StrepTag-FLAG VAP tvennd), sem aðgreinanlegt væri á jónaskiptaskilju, myndi staðfesta það að einliðu-tvíliðu jafnvægi væri til staðar. Niðurstöðurnar lofa góðu og útiloka ekki að jafnvægi eigi sér stað á milli einliða og tvíliða, en ljóst er að frekari rannsókna er þörf til að staðfesta að svo sé.

Samþykkt: 
  • 6.6.2017
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/27862


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Assessment of dimer-monomer equilibrium...pdf3.4 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna
scan.pdf497.14 kBLokaðurYfirlýsingPDF