is Íslenska en English

Lokaverkefni Háskóli Íslands > Heilbrigðisvísindasvið > Meistaraprófsritgerðir - Heilbrigðisvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/27981

Titill: 
  • Expression and purification of the causative allergens of insect bite hypersensitivity in horses and comparison of different expression systems
  • Tjáning og hreinsun á ofnæmisvökum sem valda sumarexemi í hestum og samanburður á mismunandi tjáningarkerfum
Skilað: 
  • Maí 2017
Útdráttur: 
  • Sumarexem er ofnæmi gegn ofnæmisvökum sem berast í hesta við bit smámýs af ættkvíslinni Culicoides. Ættkvíslin er ekki landlæg á Íslandi og sumarexem því óþekkt hérlendis. Tíðni sjúkdómsins er mjög há í útfluttum hestum og getur farið yfir 50% ef hestarnir eru mikið útsettir fyrir flugunni. Ofnæmið er því verulegt vandamál fyrir dýravelferð og hrossaútflutning. Einkenni sjúkdómsins eru exem með kláða sérstaklega í tagl- og faxrótum, sár geta myndast í exeminu og í þau komið sýking. Langtíma markmið er að þróa ofnæmisvaka sérhæfða ónæmismeðferð, bólusetningu sem forvörn og afnæmingu sem lækningu. Forsenda fyrir slíku eru vel skilgreindir ofnæmisvakar.
    Ofnæmisvakar sem valda sumarexemi hafa verið einangraðir úr þremur Culicoides tegundum, C. sonorensis, C. nubeculosus og C. obsoletus. Þeir hafa verið tjáðir í mismunandi tjáningarkerfum svo sem E. coli, skordýrafrumum og í byggi. Erfitt er að losna algerlega við allt inneitur þegar prótín framleidd í E. coli eru hreinsuð og mengaðir ofnæmisvakar eru ónothæfir í sum ónæmispróf. Uppruni ofnæmisvakanna er úr bitkirtlum skordýrs og við framleiðslu þeirra í heilkjörnungum er eðlilegast að tjá þá í skordýrafrumum. Framleiðsla í byggi hefur þann kost að hún er ódýrari en framleiðsla í skordýrafrumum, inneiturlaus og endurröðuð prótín eru í stöðugu umhverfi í fræhvítunni, sem tryggir langa endingu og geymsluþol.
    Fyrsta markmið rannsóknarinnar var að tjá þrjá ofnæmisvaka, Cul o 2, Cul o 5 og Cul o 7, upprunna úr C. obsoletus, í skordýrafrumum og hreinsa auk níu annarra sem áður höfðu verið tjáðir. Vakana á að setja á prótínörflögu til þess að ákvarða aðalofnæmisvakana sem á að nota í bóluefni sem og til prófunnar á sumarexemshestum fyrir afnæmingu. Annað markmið rannsóknarinnar var að bera saman tvo ofnæmisvaka í ónæmisprófum sem framleiddir voru með þremur tjáningarkerfum; E. coli, skordýrafrumum og byggi.
    Ofnæmisvakarnir voru tjáðir í skordýrafrumum með baculoveirukerfi. Tilraunir voru gerðar til að hreinsa öll prótínin á náttúrulegu formi ef hægt var en annars á afmynduðu formi. Mögulegt var að auka heimtur sumra prótína eftir hreinsun með því að tjá prótínin við 15°C í stað 27°C. Kjöraðstæður fyrir endursvipmótun voru ákvarðaðar fyrir sjö af átta prótínum sem hreinsuð voru á afmynduðu formi. Einstofna mótefni sértæk fyrir Cul n 2 og Cul o 2 (hýalúronidasar úr C. nubeculosus og C. obsoletus) voru framleidd, hreinsuð og geta nýst til prótínhreinsunnar á sæknisúlu á náttúrulegu formi.
    ELISA próf var sett upp til þess að bera saman sérvirka IgG og IgG undirflokka svörun bólusettra hesta við ofnæmisvökunum Cul n 3 og Cul n 4 framleiddum í E. coli, skordýrafrumum og í byggi. Niðurstöðurnar sýndu að endurröðuð prótín framleidd í byggi séu sambærileg hinum tveimur til að meta mótefnasvörun bólusettra hesta. Ofnæmisvakarnir voru einnig bornir saman í in vitro hvítfrumuörvunarprófi til að mæla boðefni. Sú tilraun stendur yfir.
    Þrír Culicoides ofnæmisvakar voru tjáðir í skordýrafrumum og hreinsaðir og auk níu sem áður höfðu verið tjáðir, gerðir tilbúnir til notkunnar á prótínörflögu. Bygg virðist vænlegt framleiðslukerfi fyrir ofnæmisvaka sem nota á í ónæmispróf.

  • Útdráttur er á ensku

    Insect bite hypersensitivity (IBH) or summer eczema is an allergy against proteins from the biting midge, Culicoides, not indigenous in Iceland. Consequently the horses in Iceland do not show signs of IBH. However, the frequency of IBH in exported Icelandic horses can, in heavily infested Culicoides spp. areas, be over 50%, causing a great problem for the horse industry. IBH is also a grave animal welfare issue. The clinical signs of the disease are eczema and itching, mainly at the base of the mane and the tail. Lesions are frequently formed risking secondary infections. The curative treatment against IBH would be an allergen immunotherapy (AIT), vaccination as preventive and desensitization as therapeutic. This requires well characterized allergens.
    Allergens causing IBH have been isolated from three Culicoides species, C. sonorensis, C. nubeculosus and C. obsoletus. They have been produced in E. coli, insect cells and barley. Allergens purified from E. coli are often contaminated with endotoxins and thus not usable in some immunoassays. As the allergens originate from the salivary glands of an insect, a eukaryotic host is needed to express them in their native form. For this, insect cells are the most obvious expression system to be used. However, barley has the advantage in low cost, endotoxin free production and stable storage of the recombinant protein in the seeds making it a good option.
    The first aim of this study was to express three allergens, Cul o 2, Cul o 5 and Cul o 7, originating from the salivary gland of C. obsoletus in insect cells and also purify them as well as nine other previously expressed allergens. The allergens will be used to develop a protein microarray to identify the major allergens of IBH to be used in vaccines and to test IBH affected horses before immunotherapy. The second aim was to compare two allergens, produced in E. coli, insect cells and barley in immunoassays.
    The allergens were expressed in insect cells using the baculovirus system. Attempts were made to purify as many proteins as possible in a native form but otherwise under denaturing conditions. For some proteins yield after purification was increased by producing them at 15°C rather than 27°C. Optimal refolding conditions were found for seven out of eight proteins produced in denatured form. Monoclonal antibodies specific for both Cul n 2 and Cul o 2 (the hyaluronidase from C. nubeculosus and C. obsoletus), were purified, and can subsequently be used for affinity chromatography purification of these allergens.
    The allergens Cul n 3 and Cul n 4 had been produced in E. coli, insect cells and barley. ELISA was designed to compare specific IgG and IgG subclass response of vaccinated horses to the two allergens from the three expression systems. The results indicate that proteins produced in barley are comparable to the other two, for monitoring IgG response after vaccination. The same allergens are also being compared for in vitro stimulation of peripheral blood mononuclear cells from vaccinated horses for cytokine productions. This is still ongoing.
    Three Culicoides allergens were expressed in insect cells and purified together with nine other previously expressed allergens and made ready for protein microarray. Two allergens produced in barley were shown to be good candidates for monitoring antibody respons in IBH therapy.

Samþykkt: 
  • 7.6.2017
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/27981


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Sæmundur Bjarni Kristínarson - MS Thesis.pdf11.09 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna
Yfirlýsing.pdf98.99 kBLokaðurYfirlýsingPDF