is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár) Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/29218

Titill: 
  • Áhrif viðbættra prólína í yfirborðslykkjum á hitastigsaðlögun subtilísin-líkra serín próteinasa.
Námsstig: 
  • Bakkalár
Útdráttur: 
  • Rannsóknarverkefnið er byggt á fyrri rannsóknum sem unnar hafa verið á rannsóknarstofu leiðbeinanda og snúa þær að því að útskýra forsendur hitastigsaðlögunar og þá byggingarlegu þætti sem stuðla að auknum hitastöðugleika í subtilísin-líkum serín próteinasa VPR, úr kuldakærri Vibrio tegund. Til þess að reyna að auka hitastöðugleika ensímsins voru gerðar samanburðarrannsóknir við ensímið aqualysin I (AQUI) úr hitakæru örverunni Thermus aquaticus sem hefur samsvarandi þrívíddarbyggingu og valdar stökkbreytingar fyrir VPR með tilliti til AQUI til þess að auka hitastöðugleika VPR. Notað var C-enda stytta afbrigðið af VPR (VPRΔC) við rannsóknina og tvær stökkbreytingar sem báðar hafa verið framkvæmdar áður en ekki samtímis, VPRΔC_N3P/I5P, sem olli mikilli aukningu í stöðugleika gegn hitaafmyndun, og engin áhrif á virkni og VPRΔC_T265P sem olli engri marktækri stöðugleikaaukningu né virknitapi. Tilgangur þessara rannsóknarverkefnis var að sameina þessar tvær stökkbreytingar í eitt afbrigði. Fyrrnefnda stökkbreytingin er staðsett nærri N-enda próteinsins og sú seinni nær C-enda próteinsins og er tilgátan sú að aukinn fjöldi prólína á yfirborðslykkjunum muni auka byggingarlegan stöðugleika án þess að draga úr virkni við herbergishita.
    Til að kanna áhrif stökkbreytinganna á hitastigaðlögun ensímsins voru framkvæmdar mælingar á hitaafmyndun (T50%) sem leiddu í ljós aukningu um 8°C miðað við villigerð. Einnig voru framkvæmdar bræðslumarksmælingar (Tm) og leiddu í ljós aukningu um 12°C. Til þess að ákvarða ensímvirkni sem gerðist samþætt við þessum stökkbreytingum voru hraðafræðilegar mælingar gerðar til að ákvarða Km og kcat (Michaelis-Menten) og leiddu þær í ljós ekkert marktækt virknitap.
    Niðurstöðurnar sýna að VPRΔC_N3P/I5P/T265P hefur aukin hitastöðugleika en viðheldur samt grunn virkni.

  • Útdráttur er á ensku

    The research project was based upon previous studies that have been performed at the instructor’s lab and their aim was to study the structural properties involved in temperature adaptation of a subtilisin-like serine protease, VPR, from a psychrophilic Vibrio species. To increase the thermal stability of the enzyme, mutations were selected via comparison to a homologous thermophilic enzyme, aqualysin I, from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. For this study, a truncated form of VPR was used (VPRΔC) with a shortened C-terminus. Three different mutations were combined on the VPRΔC gene, all of which had been studied previously but not simultaneously. VPRΔC_N3P/I5P, a combined mutant containing two of the three mutations, which had significantly increased the stability against temperature denaturation without a decrease of catalytic activity and VPRΔC_T265P which had no discernible change in thermal stability or catalytic activity. The aforementioned mutations are located at the N-terminus and the C-terminus respectively and the theory was that this increased number of Pro residues would increase thermal stability without decreasing catalytic activity as had been observed with the previous mutations.
    To investigate the effects the combined mutations had on temperature adaptation of the enzyme thermal denaturation measurements (T50%) were conducted which revealed an increase in stability of 8°C. Additionally the melting point of the protein was determined (Tm) and its increase from the wild type was 12°C. Determination of the catalytic activity of the mutant was conducted by change in Michaelis-Menten kinetic measurements and determination of kcat/Km. This revealed no significant decrease from the activity of a wild type enzyme.
    Results show that VPRΔC_N3P/I5P/T265P has an increased thermal stability while maintaining base activity.

Samþykkt: 
  • 25.10.2017
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/29218


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Áhrif viðbættra prólína í yfirborðslykkjum á hitastigsaðlögun subtilísin-líkra serín próteinasa. Lokaútgáfa..pdf2.31 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna
yfirlýsing.pdf507.66 kBLokaðurYfirlýsingPDF