is Íslenska en English

Lokaverkefni (Meistara)

Háskóli Íslands > Heilbrigðisvísindasvið > Meistaraprófsritgerðir - Heilbrigðisvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/29855

Titill: 
  • Titill er á ensku Development of UPLC-MS/MS method for therapeutic drug monitoring for patients with APRT deficiency
Námsstig: 
  • Meistara
Útdráttur: 
  • Útdráttur er á ensku

    Background: Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) deficiency is a rare autosomal recessive disorder. APRT deficiency prevents the normal metabolism of adenine to uric acid, which instead is being converted into 2,8-dihydroxyadenine (2,8-DHA) by xanthine oxidoreductase (XOR). 2,8-DHA is highly insoluble and is excreted by the kidneys where it can precipitate and causes kidney stones, acute kidney injury and chronic kidney disease. Allopurinol, its active metabolite oxypurinol and febuxostat are XOR-inhibitors. Light microscopy of urine is primarily used to diagnose the disease, it is however unreliable. The development of a robust method for quantification of 2,8-DHA, adenine, allopurinol, febuxostat, oxypurinol and xanthine in plasma is thus critical.
    Objective: To develop an ultra-performance liquid chromatography linked to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method and an efficient plasma sample preparation method for the simultaneous quantification of 2,8-DHA, adenine, allopurinol, febuxostat, oxypurinol and xanthine in plasma.
    Method: Different methods were developed to optimize the sample preparation. PLD+ 96well plate and SLE+ 96-well plate from Biotage (Stockholm, Sweden), Sirocco 96-well plate from Waters (Milford, Massachusetts, USA) and protein precipitation performed in Eppendorf tubes were among the approached tested. Different gradients, mobile phase flow rates and gradient slopes were tested to get cleaner MRM chromatograms for the analytes.
    Results: A promising procedure for the PLD+ 96 well plate was developed for the sample preparation prior to quantification of 2,8-DHA, adenine, allopurinol, febuxostat, oxypurinol and xanthine in plasma. The UPLC-MS/MS assay was improved by changing the gradient and mobile phase flow rate. Quantification of 2,8-DHA, allopurinol, febuxostat and xanthine along with relative quantification of oxypurinol was done in plasma from four patients with APRT deficiency.
    Conclusion: We successfully developed a UPLC-MS/MS method for the simultaneous quantification of 2,8-DHA, allopurinol, febuxostat, oxypurinol and xanthine in plasma. Further development for the UPLC-MS/MS method and the sample preparation is needed to improve the accuracy of the quantification method so it can be validated and used for therapeutic drug monitoring of patients with APRT deficiency

  • Bakgrunnur: Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) skortur er sjaldgæfur víkjandi erfðasjúkdómur. Skortur á APRT ensíminu veldur því að adenine er umbreytt í 2,8dihydroxyadenine (2,8-DHA) fyrir tilstilli xanthine oxidoreductase (XOR). 2,8-DHA, sem er mjög torleyst, er útskilið um nýru þar sem það getur fallið út og valdið nýrnasteinum, bráðum nýrnaskaða og langvinnum nýrnasjúkdómi. Allopurinol, oxypurinol (virkt umbrotsefni allopurinols), og febuxostat eru XOR-hindrar. Ljóssmásjáskoðun á þvagsýnum þar sem leitað er að 2,8-DHA kristöllum, hefur fram á þennan dag verið sú aðferð sem notuð er til að fylgja eftir árangri lyfjameðferðar, en þessi aðferð er ekki mjög áreiðanleg. Þróun á öflugri aðferð til að magngreina 2,8-DHA, adenine, allopurinol, febuxostat, oxypurinol og xanthine í blóðvökva er því mikilvæg.
    Markmið: Að þróa aðferð fyrir samhliða magngreiningu á 2,8-DHA, adenine, allopurinol, febuxostat, oxypurinol og xanthine í blóðvökva með ultra-performance liquid chromatography með raðtengdum massagreini (UPLC-MS/MS) og árangursríka aðferð til sýnameðhöndlunar
    Aðferðir: Mismunandi aðferðir voru þróaðar til að hámarka sýnameðhöndlunina. PLD+ 96brunna plata og SLE+ 96-brunna plata frá Biotage (Stokkhólmur, Svíðjóð), Sirocco 96-brunna plata frá Waters (Milford, Massachusetts, BNA) og próteinútfellingar, framkvæmdar í Eppendorf glasi, voru meðal þeirra aðferða sem voru þróaðar. Mismunandi gildi fyrir styrkhalla, flæðihraða ferðafasans og gradient slope voru prófaðar til að fá hreinni MRM (multiple reaction monitoring) krómatógrafíu fyrir 2,8-DHA, adenine, allopurinol, febuxostat, oxypurinol og xanthine.
    Niðurstöður: Vænleg sýnameðhöndlunaraðferð fyrir PLD+ 96-brunna plötuna var þróuð fyrir magngreiningu á 2,8-DHA, adenine, allopurinol, febuxostat, oxypurinol og xanthine í blóðvökva. UPLC-MS/MS aðferðin var betrumbætt með því að breyta styrkhalla og flæðihraða ferðafasans. 2,8-DHA, allopurinol, febuxostat og xanthine voru magngreind og hlutfallsleg magngreining var gerð fyrir oxypurinol í blóðvökva hjá fjórum sjúklingum með APRT skort.
    Ályktanir: Við höfum þróað UPLC-MS/MS aðferð fyrir samhliða magngreiningu 2,8-DHA, allopurinol, febuxostat, oxypurinol og xanthine í plasma. Frekari þróun er nauðsynleg fyrir UPLC-MS/MS aðferðina og aðferð við sýnameðhöndlun til að bæta nákvæmni þeirra. Í framhaldinu væri hægt að gilda aðferðirnar og nota þær við eftirlit með lyfjameðferð hjá sjúklingum með APRT skort.

Samþykkt: 
  • 25.4.2018
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/29855


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Þorsteinn Hjörtur Bjarnason_LOKA.pdf1.59 MBLokaður til...25.04.2028HeildartextiPDF
2018-04-25 11.15.11.pdf243.17 kBLokaðurYfirlýsingPDF