en English is Íslenska

Thesis (Bachelor's)

University of Iceland > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1946/30544

Title: 
  • Side chain interactions at the dimer interface of Vibrio alkaline phosphatase determine its reactivity, stability and desthiobiotin inhibition
Degree: 
  • Bachelor's
Keywords: 
Abstract: 
  • Vibrio alkaline phosphatase (VAP) is a homodimeric, psychrophilic enzyme. A homodimer is, by far, the most dominant quaternary enzyme structure found in nature. It is therefore obvious that this particular structure gives the enzymes some advantage in the evolutionary race. Many suggestions have been proposed, from stabilization effects due to a smaller surface to volume ratio, an increased ratio of active sites to surface and more recently, the idea of “cross-talking” between subunits where only one active site has catalytic capabilities at any given time.
    In this study, the enzyme was mutated to try and disrupt the dimer equilibrium. A few methods are being developed to assess this equilibrium and three of them were used for this study. CD spectroscopy monitors a change in the enzymes circular dichroism due to changes in its secondary structure. Fluorescence spectroscopy detects a change in the environment of Trp residues that cause a shift in λmax when the protein is denatured. Dilution induced dimer dissociation to monomers on the grounds of Le Chatelier’s principle. Previous studies have shown that VAP unfolding involves at least two intermediate states, one with an inactive dimer and one with unfolded monomers, before the enzyme is completely denatured, N2 → I2 → 2I → 2D.
    This study also assessed a possible inhibition of desthiobiotin (DDB) on VAP. DDB is used to elute purified enzyme samples of Strep-Tactin® affinity columns. Recently, crystal images of VAP in a solution containing DDB revealed some kind of interaction between the molecule and residues close to the active site. Results revealed inhibitory effect (Ki=0.091) at 0.25 mM DDB a 10-fold dilution compared to the concentration used for elution of purified enzymes. The exact characteristics of this inhibition are still unclear, but it is likely of a mixed noncompetitive nature.

  • Abstract is in Icelandic

    Alkalískur fosfatasi úr Vibrio (VAP) er kuldaaðlagað ensím sem myndar einsleita tvíliðu. Einsleitar tvíliður eru lang algengasta 4. stigs bygging ensíma í náttúrunni. Það er því augljóst að þessi ákveðna bygging gefur ensímum einhvers konar yfirburði fram yfir aðrar byggingar þegar kemur að þróun lífs. Margar tilgátur hafa verið lagðar fram um hvað það er sem gefur einsleitum tvíliðum þetta forskot. Allt frá stöðgandi hrifum vegna minna hlutfalls yfirborðs miðað við rúmmál og auknu hlutfalli hvarfstöðva miðað við yfirborð. Nýlega hafa komið fram hugmyndir um ”samtöl” milli undireininganna þar sem aðeins önnur hvarfstöðin hefur að bera hvötunargetu á hverju gefnu augnabliki.
    Í þessu verkefni var ensímið stökkbreytt með von um að raska tvíliðu jafnvæginu. Nokkrar aðferðir eru í þróun til að meta þetta jafnvægi og voru þrjár notaðar í þessu verkefni. Hringskautsmælingar fylgjast með breytingum í gleypni snúins ljóss sem verða vegna breyting í annars stigs byggingu ensímsins. Sundrun tvíliða í einliður við ensím þynningu byggt á lögmáli Le Chatelier. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að afmyndun VAP felur í sér a.m.k. tvö millistigs ástönd, óvirka tvíliðu og svipmyndaðar einliður, áður en próteinið afmyndast algjörlega, N2 → I2 → 2I → 2D.
    Verkefnið fól einnig í sér að meta mögulega hindrun desthiobiotin (DDB) á VAP. DDB er notað til að losa einangrað einsím af sértækri Strep-Tactin® skilju. Nýlega hafa kristallamyndir af VAP, í lausn með DDB, sýnt að sameindin binst einhvern veginn við ensímið, við amínósýruleifar nálægt hvarfstöðinni. Niðurstöðurnar sýndu fram á hindrun (Ki=0,091) við 0,25 mM DDB, 10-falda þynningu m.v. styrk DDB sem notaður er til að losa ensím af súlunni. Nákvæmir eiginleikar hindrunarinnar eru enn óskýrir en hindurnin er líklega af svokallaðri „mixed noncompetitive‟ gerð.

Accepted: 
  • May 30, 2018
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/30544


Files in This Item:
Filename Size VisibilityDescriptionFormat 
Sigridur_St_Hlynsdottir_Bs_thesis.pdf5.12 MBOpenComplete TextPDFView/Open
Skemman_yfirlysing_Sigridur_St_Hlynsdottir.pdf64.83 kBLockedYfirlýsingPDF