is Íslenska en English

Lokaverkefni (Meistara)

Háskóli Íslands > Heilbrigðisvísindasvið > Meistaraprófsritgerðir - Heilbrigðisvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/30631

Titill: 
  • Titill er á ensku Bioactivity of heparin-free platelet lysates in mesenchymal stromal cell cultures
  • Lífvirkni blóðflögulýsata án heparíns til ræktunar á mesenkímal stofnfrumum
Námsstig: 
  • Meistara
Útdráttur: 
  • Útdráttur er á ensku

    Mesenchymal stromal cells (MSCs) have become a focus in the field of regenerative cell therapy, particularly for the repair of bone and cartilage because of their multipotential differentiation to osteo-, chondro- and adipocytes. To be able to grow stem cells in vitro it is necessary to supplement the media with growth factors, chemokines, cytokines and other biomolecules. In the past, researchers have used fetal bovine serum (FBS) as a major supplement for cell growth. The use of FBS is however not ideal for cell culture due to batch-to-batch variability, risk of animal pathogen transmissions and immune reactions from bovine antigens, prions and proteins. Previous studies have shown that human platelet lysates (hPL) can be used as a supplement in cell culture, replacing FBS.
    In MSCs culture supplemented with hPL heparin has to be added to prevent fibrin formation because it can drastically decrease survival and proliferation of the cells. Heparin is a highly sulfated glycosaminoglycan, which has a complex mixture of molecules that can’t be properly characterized. Heparin is an animal derived product extracted from variation of animal tissues, such as porcine. Given that, the purpose of this study is to develop a refined platelet lysate and compare expansion and differentiation of MSCs in two different treatments, media supplemented with pathogen inactivated platelet lysate containing heparin (PIPL) versus refined-pathogen inactivated platelet lysate deprived of heparin, but contains instead citrate phosphate dextrose (CPD) (R-PIPL).
    Platelet lysates were made with a freeze-thaw method, filtered and added to DMEM F12 + Glutamax media with (PIPL) or without (R-PIPL) heparin. Growth rate analysis was done with population doubling assay (PDA) and morphology was evaluated with microscopy. Osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation was performed to validate tri-lineage differentiation potential of MSCs. Osteogenic differentiation was evaluated with gene expression, alkaline phosphatase activity assay and Alizarin red staining for mineralization. Oil red O staining and gene expression was performed to evaluate adipogenic differentiation and hematoxylin & eosin as well as Masson’s trichrome staining in addition to glycosaminoglycan (GAG) assay for chondrogenic differentiation. Endochondral ossification was evaluated with Alizarin red staining.
    Results showed comparable morphology between cells grown in both PIPL and R-PIPL and differentiation was carried out in both treatments. MSCs grown in 10% PIPL showed a slightly faster growth and in osteogenic differentiation, more mineralization was observed. However, observation of the osteogenic marker RUNX2 showed more expression in 10% R-PIPL. These differences were not significant. Chondorgenic differentiation was comparable as well but gene expression of the adipogenic marker PPARγ was higher in 10% PIPL. The findings demonstrate that R-PIPL can be used to grow MSCs in vitro but some improvements and further experiments are needed to confirm the effect on differentiation and growth rate.

  • Mesenkímal stofnfrumur (MSCs) eru alltaf að verða mikilvægari í sambandi við endurnýjandi frumumeðferð, sérstaklega þegar kemur að viðgerð á beinum og brjóski vegna sérhæfingamöguleika þeirra í bein- brjósk- og fitufrumur. Til þess að hægt sé að rækta stofnfrumur in vitro þarf að bæta við frumurætið bætiefni sem inniheldur vaxtarþætti, efnatoga, frumuboðefni og önnur lífefni. Til dagsins í dag hafa vísindamenn notað kálfasermi (FBS) sem bætiefni en notkun á kálfasermi er ekki æskilegur kostur vegna breytileika á milli lota, hættu á smiti dýraveira og ónæmisviðbragða við dýramótefnum og próteinum. Fyrri rannsóknir hafa sýnt fram á að hægt sé að nota mennsk blóðflögulýsöt (hPL) sem bætiefni í frumuræktanir og þannig skipt út kálfasermi.
    Bæta þarf við heparíni í MSC rækt sem er viðbætt með hPL til að koma í veg fyrir fíbrín myndun, en slíkt getur dregið úr lifun og fjölgun frumna. Heparín er mjög súlfötuð sykra sem hefur flókna uppbyggingu af sameindum sem ekki er hægt að greina að fullu, auk þess sem það er dýraafurð sem er fengin úr mismunandi dýravefjum, til dæmis smágörnum svína. Tilgangur þessarar rannsóknar er því að þróa bætt blóðflögulýsat og bera saman vöxt og sérhæfingu MSCs í tveimur mismunandi meðferðum, æti viðbættu smithreinsuðu blóðflögulýsati sem inniheldur heparín (PIPL) og æti með bættu smithreinsuðu blóðflögulýsati sem er án heparíns, en inniheldur í staðinn sítrat fosfat dextrósa (CPD) (R-PIPL).
    Blóðflögulýsöt voru gerð með frysta-þýða (freeze-thaw) aðferð, síuð og bætt í DMEM F12 + Glutamax æti með (PIPL) eða án (R-PIPL) heparíni. Vaxtarhraði var metinn með frumufjölgunarprófi (PDA) og útlit skoðað með smásjá. Bein-, fitu- og brjósksérhæfing var gerð til að sýna fram á þrí-sérhæfingarmöguleika MSC. Beinsérhæfing var metin með genatjáningu, virknimælingu á alkalískum fosfatasa og Alizarin red litun fyrir steinefnaútfellinguna. Oil red O litun ásamt mati á genatjáningu var gerð til að meta fitusérhæfingu og hematoxylin & eosin og Masson’s trichrome litun ásamt glýcósamínóglýcan (GAG) magnmælingu notað til að meta brjósksérhæfingu. Brjóskmiðuð beinmyndun var skoðuð með Alizarin red litun.
    Niðurstöður sýndu samsvarandi útlit milli fruma ræktaðar í bæði 10% PIPL og 10% R-PIPL og sérhæfing tókst í báðum meðferðum. Lítilsháttar munur var á vaxtarhraða þar sem MSC ræktaðar í 10% PIPL uxu hraðar. Í beinsérhæfingu var meiri steinefnaútfelling sýnileg í 10% PIPL en þegar genatjáning var skoðuð var meiri tjáning á beinmarkernum RUNX2 þegar MSC voru ræktaðar í 10% R-PIPL. Munurinn var hins vegar ekki marktækur. Brjósksérhæfing var einnig sambærileg en munur var á fitumarkernum PPARγ þar sem meiri tjáning var í 10% PIPL. Niðurstöðurnar benda til þess að möguleiki sé á að nota R-PIPL til að rækta MSC in vitro en einhverjar endurbætur þarf að gera ásamt frekari rannsóknum til að staðfesta áhrif á sérhæfingar og vaxtarhraða.

Samþykkt: 
  • 5.6.2018
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/30631


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Sara Þöll Halldórsdóttir - Thesis for the degree of Master of Science.pdf12.13 MBLokaður til...01.06.2020HeildartextiPDF
yfirlýsing um meðferð verkefnis.pdf245.27 kBLokaðurYfirlýsingPDF