Áhrif líftæknilyfjanna tocilizumab og anakinra á sérhæfingu og virkni CD8+ Tst

Abstract

Það er hlutverk ónæmiskerfisins að halda innra jafnvægi í líkamanum með því að hemja og útrýma óæskilegum sameindum. CD8+ T stýrifrumur (Tst) gegna mikilvægu hlutverki í ónæmiskerfinu með því að bæla eða hindra ónæmisviðbrögð í líkamanum. Líftæknilyf á borð við tocilizumab (anti-IL-6 einstofna mótefni) og anakinra (anti-IL-1β einstofna mótefni) hafa verið notuð til meðhöndlunar á ýmsum ónæmissjúkdóma og er því áhugavert að skoða þessi lyf og áhrif þeirra á CD8+ Tst. Markmið verkefnisins var að meta og greina hlutverk IL-6 og IL-1β á sérhæfingu og virkni CD8+ Tst.Óreyndar manna T frumur voru einangraðar úr einkjarna blóðfrumum með Ficoll Histopague og síðan neikvætt og jákvætt valdar með tilliti til CD8+/CD45RA+ markera. Óreyndar CD8+/CD45RA+ frumur voru virkjaðar með anti-CD3ε og anti-CD28ε og ræktaðar með IL-2 og TGF-β1 með/án anti-IL-6 (tocilizumab: 0.1/10/1000 μg/mL) og anti-IL-1β (anakinra: 0.5/5/500 μg/mL) í 120 klst. CD4+ Tst hafa verið skilgreinar sem CD4+/CD127-/CD25+/FoxP3+ og var ákveðið að skilgreina CD8+ Tst frumurnar sem CD8+/CD127-/CD25+/FoxP3int/hi, en að auki voru CD8+/CD127-/CD25+/FoxP3-, CD8+/CD127-/CD25-/FoxP3int ákvarðaðar og skoðaðar með flæðifrumusjá. Tjáning og seyting innan- og utanfrumuboðefna var skoðuð með FACS og luminex með sérstaka áherslu á IL-6, IL-9, IL-1β og PD1.Tjáning CD8+ Tst í rækt með IL-2 og TGF-β1 jókst og voru skilgreinar sem CD8+/CD127-/CD25+/FoxP3int/hi. Bæði anti-IL-6 og anti-IL-1β hindraði sérhæfingu CD8+ Tst. Að auki hindraði anti-IL-6 tjáningu PD1 viðtakans. Í IL-2 og TGF-β1 hvetjandi aðstæðum jókst seyting á IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-18, IL-21 og IL-22, TNFα, IFNγ og GM-CSF. Hinsvegar, þegar anti-IL-6 var til staðar, hindraði það seytingu á IL-21 og IL-22. Enn fremur hindraði anti-IL-1β seytun á IL-6 boðefninuTekið saman, þá virðast CD8+ Tst vera háðar IL-6 þar sem anti-IL-6 hindrar sérhæfingu þeirra en að auki virðist PD1 gegna mikilvægu hlutverki í ferli CD8+ Tst. Anti-IL-1β hindrar seytingu á IL-6 boðefninu sem gæti bent til þess að IL-1β sé hvatað af IL-6 tjáningu. Þegar tocilizumab er bætt í rækt með CD8+ Tst minnkar seytun á IL-21 og IL-22 sem gæti bent til mögulegs meðferðaúrræði með anti-IL-6 í B frumu tengdum ónæmissjúkdómum.

Growing evidence suggest that defective regulation is the underlying cause of many autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis (RA), Crohn’s and psoriasis. CD8+ T regulatory cells (Tregs) are crucial component of the immune system and important to maintain tolerance as well as to modulate adaptive immune response by their suppressive function. Two biological drugs, tocilizumab (anti-IL-6 receptor mAb) and anakinra (anti-IL-1β mAb) have been used for the treatment of autoimmune diseases, and it is therefore interesting to examine these drugs and their affect on CD8+ Tregs.The aim of this study was to evaluate the role of IL-6 and IL-1β on the differentiation and expression/secretion profile of CD8+ iTregs. Naïve human T cells (CD8+/CD45RA+) were isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and stimulated with anti-CD3ε and anti-CD28ε in the presence of IL-2 and TGF-β1 with/without anti-IL-6 (tocilizumab: 0.1/10/1000 μg/mL) and anti-IL-1β (anakinra: 0.5/5/500 μg/mL) for 120 hrs. CD4+ iTregs have previously been classified as CD4+/CD127-/CD25+/FoxP3+ and therefore we defined the CD8+ iTregs as CD8+/CD127-/CD25+/FoxP3int/hi, but additionally other phenotypes were defined; CD8+/CD127-/CD25+/FoxP3- and CD8+/CD127-/CD25-/FoxP3int. The phenotypes were evaluated by flowcytometric analyses as well as their intracellular and cytokine secretion pattern was evaluated with flowcytometry and luminex with special interest on IL-6, IL-9, IL-1β and PD1.The classical phenotype of CD8+ iTregs (CD8+/CD127-/CD25+/FoxP3int/hi) was significantly induced with IL-2 and TGF-β1 compared to uninduced CD8+ T cells. Both anti-IL-6 and anti-IL-1β inhibited their induction in a dose depended manner. Anti-IL-6 treatment led to the reduction of PD1 cellular CD8+ iTregs expression. Furthermore, the induction of iTregs in the presence of IL-2 and TGF-β1 resulted in an increased secretion of IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-18, IL-21, IL-22, TNFα, IFNγ and GM-CSF. Furthermore, treatment with anti-IL-1β reduced secretion of IL-6.To sum up, the CD8+ iTregs induction is strongly dependent upon the presence of IL-6. This may be driven through a PD1 dependent intracellular mechanism. However, the role of IL-1β on CD8+ iTregs may be driven through IL-6 induction. Since both IL-21 and IL-22 are reduced following tocilizumab treatment during in vitro stimulation of CD8+ Tregs, it may suggest their potential therapeutic role in a B-cell driven autoimmunity.