The effect of amotosalen treatment on human platelet lysate bioactivity: Effects on proliferation and tri-lineage differentiation of mesenchymal stromal cells

Abstract

Áhugi á mesenkímal stofnfrumum (e. Mesenchymal stromal cells, MSC) hefur aukist mikið undanfarin ár. Sérstakleg vegna þess að mögulega má nota frumurnar sem hluta af klínískum frumumeðferðum. MSC styðja við gróanda eftir vefjaskaða bæði með því að sérhæfast yfir í frumur sem byggja upp heilbrigðan vef og með því að móta ónæmissvör gegnum seytingu á lífvirkum efnum. Notkun á MSC í meðferðarskyni lofar góðu en krefst þess þó að þeim sé fjölgað utan líkama til að ná upp nægilegum frumafjölda fyrir meðferð. Frumunum er fjölgað í ræktunaræti sem inniheldur vaxtaþætti og aðra hvata sem að örva frumuvöxt. Sermi er ríkt af þessum nauðsynlegu þáttum og er algengast að bæta kálfasermi (e. Fetal bovine serum) við ræktunarætið, en kálfasermi inniheldur dýraprótein og mikill breytileika á milli lota er vel þekktur. Kálfasermi er ekki talið henta til að rækta frumur fyrir frumumeðferðir sökum þess að misræmi milli tegunda er talið ógna öryggi hugsanlegra sjúklinga og breytileikinn dregur úr gæðum og stöðugleika meðferða. Lausnir sem unnar eru úr mennskum blóðflögum hafa verið rannsakaðar semn staðgenglar kálfasermis til frumurækta. Slíkar lausnir eru einnig ríkar af vaxtaþáttum og hvötum sem örva frumuvöxt. Lausnirnar eru oftast í formi roflausna þar sem blóðflögurnar hafa verið sprengdar upp (e. Platelet lysate) og innihalda þær mennsk prótein og sýna minni breytileika á milli lota en kálfasermi. Hægt er að framleiða slíkar blóðflögulausnir með því að nota útrunnar blóðflögueiningar frá blóðbönkum sem hafa verið smithreinsaðar. Rannsóknir hafa ítrekað sýnt fram á yfirburði slíkra lausna til að styðja við MSC í rækt. Mikilvægt er að tryggja stöðlun og GMP framleiðslu sé ætlunin að blóðflögulausni í tengslum við frumumeðferðir. Sem dæmi, þá þarf að tryggja að ekki berist sýklar sem valda smitsjúkdómum í mönnum með blóðflögulausnunum. Tilkoma smithreinsunartækni hefur dregið verulega úr þeirri áhættu, þá sérstaklega þegar notuð er INTERCEPT™ tæknin sem byggir á hæfni amotosalen til að óvirkja sýkla í blóðflöguþykknum. Tækninni er beitt í blóðbönkum á heilar blóðflögur í blóðflöguþykkni sem eru ætluð til blóðgjafar. INTERCEPT™ tæknin er nýleg og enn eru margir blóðbankar sem að framleiða blóðflöguþykkni til blóðgjafar án þess að beita smithreinsunaraðferðum. Aðgangur að blóðflögueiningum sem hafa verið smithreinsaðar er takmarkaður. Hér var sett fram tilgáta um að hægt væri að útbúa blóðflögulausn sem er smithreinsuð eftir að blóðflögurnar hafi verið sprengdar. Slíkt gæti verið skref í átt að staðlaðri framleiðslu og aukið aðgengi að slíkum lausnum.Blóðflögulausnir voru útbúnar úr útrunnum blóðflögueiningum en smithreinsun var annaðhvort framkvæmd á heilum blóðflögum rétt eftir blóðsöfnun líkt og venjan er (PIPL) eða eftir að blóðflögurnar höfðu verið sprengdar (PILA). Áhrif á próteinsamsetningu lausnanna sem og in vitro frumufjölgun og þrískipt sérhæfing MSC var metin og borin saman á milli fruma sem ræktaðar voru með PIPL eða PILA. Niðurstöðurnar sýna að PILA (i) studdi frumufjölgun til langs tíma án þess að hafa áhrif á útlit fruma og (ii) studdi við þrískipta sérhæfingu MSC samanborið við PIPL. Sýnt var fram á niðurstöðurnar með samanlögðu frumufjölgunarprófi og með því að fylgjast með steinefnaútfellingum, myndun kollagen þráða og uppsöfnun á lípíðum í bein-, brjósk og fitusérhæfingu, talið upp í réttri röð. Styrkur vaxtaþátta og frumuboða var að jafnaði lægri í PILA samaborið við PIPL.Hér er sýnt fram á að það er mögulegt að fjölga og sérhæfa MSC með því að nota útrunnar smithreinsaðar blóðflögulausnir þar sem smithreinsun er beitt eftir að blóðflögur hafa verið rofnar. Frekari rannsókna á áhrif á samsetningu lausnanna og áhrif á ónæmismótun mesenkýmal stonfruma er þó þörf.

Mesenchymal stromal cells (MSCs) have become a subject of increased scientific interest in the past years due to their clinical potential. Cell-based therapies utilize the ability of MSCs to home to injured tissues and either differentiate into mature cell types of the connective tissues or modulate immune responses by secretion of bioactive molecules. Clinical application of MSCs usually require in vitro expansion to reach clinically relevant numbers which necessitates supplementation of cell culture media with growth factors and other mediators to stimulate cell growth. Fetal bovine serum (FBS) as a source of mitogens is considered the gold standard for that purpose, but FBS exposes cells to xenogeneic proteins and has a large batch-to-batch variability. This can potentially complicate research reproducibility and put patient safety at risk.Platelet derivatives such as human platelet lysates (HPL) are considered possible alternatives to FBS due to their abundance of growth factors and cytokines. In addition, HPL is non-xenogeneic and demonstrate lower batch-to-batch variation due to the possibility of pooling larger number of units. HPL is efficiently produced by subjecting platelet concentrates to cycles of freeze-thawing resulting in degranulation. Multiple studies have demonstrated its ability to support growth of MSCs more efficiently than FBS. However, standardization of commercial GMP grade HPL is imperative to ensure high quality and safety. One concern regarding the use of HPL is the risk of transmitting human pathogens to the recipient. The introduction of pathogen inactivation systems, such as the INTERCEPT™ Blood System which relies on amotosalen as the active compound, has reduced this risk significantly. But this does not always apply as most platelet concentrates are produced in the absence of pathogen inactivation. Thus, we hypothesized that functional HPL could be produced by applying pathogen inactivation to expired and untreated platelet lysates. This could potentially permit the use and improve the safety of conventionally treated platelet concentrates in HPL production.In this study, platelet lysates were produced by subjecting expired and untreated platelet concentrates to pathogen inactivation after platelet lysis (PILA). The effect on platelet lysate composition as well as in vitro cell proliferation and tri-lineage differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSC) was compared to conventional expired and pathogen inactivated platelet lysates (PIPL). The results show that PILA was able to (i) support long-term proliferation of MSCs in vitro without altering the morphology and (ii) support tri-lineage differentiation of MSCs comparable to PIPL. This was demonstrated by cumulative population doublings over time in cell culture as well as observing mineralization, lipid droplet formation and collagen fiber formation during osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation, respectively. As an effect of the pathogen inactivation, an overall decrease in the concentration of soluble growth factors and cytokines in PILA compared to PIPL was observed.In this study, it was demonstrated that it is possible to expand and differentiate MSCs into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages using expired platelet concentrates that are pathogen inactivated after lysis. Therefore, these results suggest that pathogen inactivation can be applied to platelet lysates derived from platelet concentrates of blood processing institutions that use conventional bacterial screening methods. However, more research on the composition of the platelet lysates and the immunomodulatory profile of MSCs expanded in PILA is required.