Microtubule associations of Pontin and Reptin: Roles in the dendritic arbor of Drosophila sensory neurons

Abstract

Pontin and Reptin are two highly conserved members of the AAA+ (ATPases Associated with diverse cellular Activities) family, and are involved in diverse processes such as chromatin remodeling, cell signaling, and migration. Interactions of both Pontin and Reptin with motor proteins and tubulins have been observed in multiple species. This project focuses on verifying these interactions and studying the microtubule-related roles of Pontin and Reptin in Drosophila melanogaster. In particular, knock-down of Pontin or Reptin in dendritic arbor sensory neurons (ddaC IV neurons) causes beading in the dendrites, which may indicate transport failure, microtubule disorganization, or aggregate formation. Associations between Pontin or Reptin and motor proteins or tubulins were determined via co-immunoprecipitation and Western blot. To examine the possible phenotype of beading in the dendrites, experiments were performed modulating the level of expression or functionality of Pontin or Reptin in ddaC IV neurons, using transgenic fly lines in crosses knocking down, over-expressing, or introducing Walker mutations to Pontin or Reptin. Confocal microscopy was performed on fluorescently labeled ddaC IV neurons of live Drosophila larvae, and the resulting images were analyzed for overall arbor shape, visible beading, and distribution of intersections using Sholl analysis. Knock-down of Pontin and Reptin led to a more beaded arbor, while kinase-dead (Walker motif) mutations of Pontin and Reptin contributed to beading in a similar but less pronounced way, with Walker A mutations producing a more severe effect than Walker B mutations.

Pontin og Reptin eru vel varðveitt prótein í AAA+ ATPasa fjölskyldunni og gegna hlutverki í ýmsum ferlum, eins og endurröðun litnis, boðferlum og fari fruma. Tengsl bæði Pontin og Reptin við mótor prótein og tubulin hafa verið staðfest í nokkrum tegundum. Þetta verkefni einblínir á þessi tengsl, að staðfesta þau frekar sem og greina örpíplu-tengd hlutverk Pontin og Reptin í Drosophila melanogaster. Bæling Pontin eða Reptin í skyntaugafrumum (ddaC IV taugafrumum) veldur hnútamyndun í griplum skyntaugafrumanna, sem gæti gefið til kynna hindrun á flutningi, óstöðuleika örpípla, eða myndun kekkja (aggregates). Tenging Pontin eða Reptin við mótor prótein eða tubulin, voru ákvörðuð með mótefnaútfellingu (co-immunoprecipitation) og Western blotti. Til að kanna svipgerð hnútamyndunar í skyntaugafrumum var tjáningu Pontin eða Reptin í þeim breytt með því að æxla saman erfðabreyttum ávaxtaflugum til að ýmist slá niður, yfirtjá eða innleiða stökkbreytingar í Walker kínasasetum þeirra. Lagsjá var nýtt til að greina flúrljómandi ddaC IV taugafrumur í lifandi flugulirfum og myndirnar greindar m.t.t. heildarlögunar griplanna, sjánlegra hnúta í þeim auk þess sem greinafjöldi var metinn með Sholl greiningu. Bæling á Pontin eða Reptin leiddi til aukinnar hnútamyndunar og Walker stökkbreytingar juku einnig á hnútamyndun en þó ekki í eins miklum mæli, Walker A hafði þar meiri áhrif en Walker B stökkbreytingar.