Characterization of a mammalian specific region of ATG7

Abstract

Introduction: Autophagy is a cell degradation pathway and is upregulated during starvation. It is the cell’s way to clean up faulty cellular components, survive different stressors, such as starvation, as well as being a source of energy for the cell. Autophagy has been shown to be defective in a variety of diseases. Defective autophagy can result in tumor formation. However, tumor cells seem to be able to use autophagy to survive environmental stress. Currently, autophagy inhibitors such as hydroxychloroquine are being investigated in clinical trials as a cancer therapy option. Autophagy-related (ATG) proteins are crucial for the autophagy process. The lab recently identified a rare germline coding variant in the essential autophagy-related gene ATG7 which increases the risk of hepatic cancer. This variant resides in a mammalian specific region of the ATG7 protein. Last summer, I received a grant to study this mammalian specific region in the human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line Huh7. That summer, I examined the effect of over-expressing an ATG7 protein with this region deleted in the Huh7 cells. Because the results from those experiments were interesting, I wanted to investigate this region further using a different HCC cell line.Materials and methods: Vectors containing deletion of the mammalian specific region were made. HepG2 HCC cells were used for the experiments. Stable cell lines expressing Flag-tagged wild-type (wt) ATG7 as well as ATG7 lacking the mammalian specific region (delMSR) were prepared for both isoform 1 and 2 of ATG7; wt (1), wt (2), delMSR (1) and delMSR (2). An empty vector (EV) control cell line was included. The cells were seeded for western blots to confirm that transfection was successful and to evaluate the expression of ATG7. The cells were seeded for confocal analysis and images acquired using Olympus FLV1200 confocal microscope.Results: According to the western blots, transfection was successful. Expression of ATG7 was lower among delMSR (1) cells compared to delMSR (2) cells. The confocal analysis showed delMSR (1) cells to be irregular, with deformed nuclei and cytoplasm. Wt (1) cells clustered together unlike wt (2), delMSR (1) and delMSR (2).Discussion: We have found that over-expression of ATG7 delMSR severely affects the cellular morphology of HCC cells, showing an important function of the region. It was shown that the delMSR in isoform 1 of ATG7 affected the cell shape of HepG2 cells. However, for Huh7 cells, the effect was seen with the delMSR in isoform 2 instead. Protein levels of ATG7 were furthermore very low for delMSR (1) in the HepG2 cells according to western blot. However, they were higher for delMSR (1) in the Huh7 cells. In the Huh7 cells, protein expression was very low for delMSR (2) and was in the form of puncta in the cytoplasm as opposed to uniform cytoplasmic staining of wt ATG7. These results lead to interesting speculations such as what is the main difference between these two cell lines? Can that explain the different results? One explanation is that the tumor suppressor gene p53 is accumulated and mutated in the Huh7 cell line whereas HepG2 cells contain normal p53. Studies have shown p53 to have a role in autophagy and even bind to Atg7. Whether it binds to the mammalian specific region is not known but would be interesting to investigate.

Inngangur: Sjálfsát (e. autophagy) er niðurbrotsferli frumunnar og virkjast t.d. við svelti og álags aðstæður (e. environmental stress). Fruman nýtir sér sjálfsát til þess að brjóta niður gölluð prótein og frumulíffæri en einnig til orkumyndunar. Gallað sjálfsát tengist ýmsum sjúkdómum. Rannsóknir hafa sýnt að sjálfsát verndi gegn krabbameinsmyndun. Hins vegar geta krabbameinsfrumur nýtt sér sjálfsát til þess að lifa af erfiðar aðstæður. Verið er að rannsaka sjálfsátshemla eins og hydroxychloroquine sem meðferðarmöguleika í krabbameinum. Sjálfsátsprótein (ATG prótein) eru nauðsynleg fyrir sjálfsátsferlið. Rannsóknarstofan greindi nýlega sjaldgæfan breytileika (e. variant) í sjálfsátsgeninu ATG7 sem eykur líkur á lifrarkrabbameini. Þessi breytileiki er á spendýrasértæku svæði í ATG7. Ég hlaut styrk síðasta sumar til þess að rannsaka þetta svæði í lifrarkrabbameinsfrumulínunni Huh7. Þá skoðaði ég áhrif þess að slá út svæðið og yfirtjá ATG7. Þar sem niðurstöðurnar voru áhugaverðar langaði mig að rannsaka þetta svæði í annarri lifrarkrabbameinsfrumulínu.Efni og aðferðir: Vektorar með eyðingu á spendýrasértækasvæðinu voru útbúnir. HepG2 lifrarkrabbameinsfrumur voru notaðar fyrir tilraunirnar. Stöðugar frumulínur sem tjá Flag-merkt villigerðar (wt) ATG7 annars vegar og hins vegar ATG7 án spendýrasértækasvæðisins (delMSR) voru útbúnar fyrir isoform 1 og 2 af ATG7: wt (1), wt (2), delMSR (1) og delMSR (2). Tómur vektor (e. empty vector) var notaður sem control. Western blot var gert til að staðfesta að klónunin tókst og til þess að meta tjáningu á ATG7. Frumurnar voru einnig skoðaðar í lagsjá og myndir teknar.Niðurstöður: Klónunin tókst. Tjáning á ATG7 var minni meðal delMSR (1) frumna miðað við delMSR (2). Svipgerð delMSR (1) var mjög afbrigðileg, afmyndaðir kjarnar og umfrymi. Wt (1) mynduðu þyrpingar ólíkt wt (2), delMSR (1) og delMSR (2).Umræða: Yfirtjáning á ATG7 delMSR frumum hefur mikil áhrif á svipgerð frumnanna sem bendir til þess að svæðið gegni mikilvægu hlutverki. Samanburður á Huh7 og HepG2 frumulínunum sýnir að delMSR hefur áhrif á svipgerð frumna þegar það er tjáð í ATG7 isoform 1 meðal HepG2 frumna annars vegar og hins vegar þegar það er tjáð í ATG7 isoform 2 meðal Huh7 frumna. Tjáning ATG7 var einnig mjög lág meðal delMSR (1) HepG2 frumna en hins vegar var hún mun hærri meðal delMSR (1) Huh7 frumna. Tjáningin var mjög lág meðal delMSR (2) Huh7 frumna og kom fram sem punkar í umfrymi öfugt við wt (2) þar sem umfrymið litaðist jafnt. Þessar niðurstöður leiddu til spurninga eins og hver er munurinn á þessum tveimur frumulínum? Getur hann útskýrt þessar niðurstöður?Einn munur á frumulínunum er að æxlisbælisgenið p53 er stökkbreytt og safnast upp í Huh7 frumulínunni en ekki í HepG2. Rannsóknir hafa sýnt að p53 hafi mikilvægt hlutverk í sjálfsáti og að það geti jafnvel bundist Atg7. Hvort það geti bundist spendýrasértækasvæðinu er ekki vitað en það er áhugaverð tilgáta.