is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár) Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/33214

Titill: 
  • Áhrif stökkbreytinga við N-enda á hitastöðugleika kuldaaðlagaða subtilísin-líka serín próteasans VPR
  • Titill er á ensku The effect of N-terminal mutations on the thermostability of VPR, a cold active subtilisin-like serine protease
Námsstig: 
  • Bakkalár
Efnisorð: 
Útdráttur: 
  • Rannsóknarverkefnið byggir á fyrri rannsóknum varðandi byggingareinkenni sem ákvarða hitastigsaðlögun í mismunandi próteinum, þar sem borin voru saman tvö samstofna ensím: C-enda stytt afbrigði af kuldaaðlöguðu VPR (VPR∆C) úr kuldakærri Vibrio örveru, og hitastöðugt aqualysin I (AQUI) úr hitakæru örverunni Thermus aquaticus. Stökkbreytingar við N-endann hafa áhrif á víxlverkanir milli N-enda lykkjunnar og meginbyggingar þessara ensíma og þ.a.l. á hitastöðugleika þeirra. Tvöfalda prólín stökkbreytingin N3P/I5P jók hitastöðugleika VPR meðan að W6F stökkbreytingin lækkaði hann. Tilgangur þessa verkefnis var að tjá allar þrjár stökkbreytingarnar samtímis í einu afbrigði, VPR∆C/N3P/I5P/W6F, til að skoða áhrif þeirra á hitastöðugleika og hraðafræðilega eiginleika, þ.e.a.s. að athuga hvort jákvæð áhrif N3P/I5P á hitastöðugleika VPR trompi neikvæð áhrif W6F. N3P/I5P/W6F afbrigðið sýndi lægri hvötunarvirkni en villigerðarensímið. Hún var einnig lægri en hvötunarvirkni N3P/I5P og W6F afbrigðanna. Hitastöðugleikamælingar á N3P/I5P/W6F afbrigðinu gáfu lægri Tm og T50% gildi en fyrir villigerðina, ∼12-13 °C lægra og ∼3 °C lægra, í hvoru tilfelli. Tm og T50% voru lægri en hjá N3P/I5P afbrigðinu, Tm var einnig lægra en hjá W6F afbrigðinu. T50% var hins vegar hærra en hjá W6F, og það sem meira er, ∼1 °C hærra en Tm sem hefur aldrei mælst hingað til í öðru afbrigði VPR. Byggingin umhverfis hvarfstöðina gæti verið stöðugri en annars staðar í ensíminu. DSC mæling á VPR∆C/N3P/I5P/W6F renndi stoðum undir þessa ályktun, en hún gaf til kynna að a.m.k. einn varmafræðilegur atburður á sér stað við hærra hitastig en hjá hinum. Jákvæð áhrif N3P/I5P á hitastöðugleika VPR trompa því ekki neikvæð áhrif W6F.

  • Útdráttur er á ensku

    This research project is a part of a larger project aimed at determining the structural basis for temperature adaptations in proteins by studying two subtilisin-like serine proteases that are structurally homologous: A C-terminal truncated form of the cold-active VPR (VPR∆C), from a psychrophilic Vibrio species, and the thermostable aqualysin I (AQUI), from the thermophile Thermus aquaticus. Substitutions close to the N-terminus affect interactions between the N-terminal loop and the main body of these enzymes, which in turn affects their thermostability. The double proline substitution N3P/I5P increased the thermostability of VPR but the W6F substitution decreased it. The purpose of this project was to express all three mutations simultaneously in one variant, VPR∆C/N3P /I5P/W6F, and observe their effect on both thermostability and kinetic parameters, i.e. to see whether the stabilizing effect of N3P/I5P could overcome the destabilizing effect of W6F. The N3P/I5P/W6F variant displayed much lower catalytic activity than the wild type enzyme and both N3P/I5P and W6F variants. Thermostability measurements generated lower Tm and T50% values than for the wild type enzyme, ∼12-13 °C lower and ∼3 °C lower, respectively. Both Tm and T50% were lower than those of the N3P/I5P variant, Tm was also lower than that of the W6F variant. The T50% was however higher than that of the W6F variant, and more interestingly, ∼1 °C higher than Tm which has never been observed before in any variant of VPR. This could be due to the scaffold around the enzymes active site being more stable than the surrounding structures. Indeed, a DSC measurment of VPR∆C/N3P/I5P/W6F revealed at least one thermal event occuring at a higher temperature than the rest. The stabilizing effect of N3P/I5P was apparently insufficient to overcome the destabilizing effect of W6F.

Samþykkt: 
  • 24.5.2019
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/33214


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
BS_Ritgerd___ATH.pdf3.91 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna
Yfirlysing.pdf118.24 kBLokaðurYfirlýsingPDF