Transformation of P. tricornutum by electroporation

Abstract

The objective of this project was to transform the diatom P. tricornutum by electroporationin order to optimize the method. A test protocol was composed in order to incorporate zeocinresistant pPha-T1-GFP plasmid, linearized by ScaI-HF digestion. Transformation of P.tricornutum with electroporation is not entirely new nor is it common either due to pooryield of transformants. Electroporation is a method that offers simple solutions, especially ifit’s combined with a successful optimizing protocol. It´s commonly thought that theelectroporation itself is a major factor in limited viability but other aspects have not reallybeen pursued as preparation steps regarding the procedure might also be a limiting factore.g. even the centrifuge speed could compromise the yield. As it turned out the centrifugespeed was limiting viable cells, either by killing them before electrophoresis or leaving themto week to survive the electroporation. After adjustments of the protocol, viabletransformants emerged that were verified by their selective markers i.e. showing zeocinresistance and expression of eGFP.

Markmið þessa verkefnis var að umbreyta kísilþörungnum P. tricornutum með rafgötun tilað bæta heimtur. Tilraunaáætlun var sett saman til þess að koma inn zeocin þolnu pPha-T1-GFP plasmíði, klipptu með ScaI-HF skerðisensími. Umbreyting á P. tricronutum meðrafgötun er ekki óþekkt aðferð en hún er almennt ekki talin hagkvæm þar sem hún gefurfremur litlar heimtur af lífvænlegum kísilþörungum. Rafgötun er í sjálfu sér einföld aðferð,sérstaklega ef mögulegt er að hámarka heimtur. Almennt er talið að rafgötunin sjálf leiði tillélegra heimta en fátt er um að leitað hafi verið eftir öðrum þáttum sem gætu haft neikvæðáhrif á heimturnar. Þar má nefna hraða skilvindu sem dæmi um takmarkandi þátt. Í reyndkom í ljós að harkalegur spuni í skilvindu takmarkaði lífvænlegar frumur, annaðhvort meðþví að drepa þær eða veikja þær of mikið til að þola rafgötunina. Breytingar voru gerðar áverklagi er leiddi til lífvænlegra, umbreyttra kísilþörunga sem síðan fékkst staðfest í gegnumsértæka merkingu m.ö.o. sýndu zeocin-þol og tjáningu á eGFP.