The interplay between TGFβ and Thrombospondin 1 in endothelium and breast cancer

Abstract

Breast cancer is the most common cancer in women worldwide and the prognosis of patients worsens significantly with the diagnosis of metastatic growths. Tumors depend on blood vessels for the delivery of oxygen and nutrients necessary for their growth, but recent evidence suggests that blood flow independent effects from vessels have important regulatory role in the microenvironment of tumors. Endothelial cells (ECs) line the vessels of the circulatory system and are important effectors in angiogenesis (the formation of new blood vessels) and in the tumor microenvironment. Recent evidence suggests that disseminated tumor cells stay dormant if they reside close to stable endothelium, where no new vessels are forming. Under these circumstances the endothelium expresses thrombospondin 1 (TSP1), which is a glycoprotein with well established anti-angiogenic effect. However, at sites of active angiogenesis, tumor cells can exit dormancy and start proliferating. The TGFβ signaling pathway affects both angiogenesis and tumor progression. ECs have two different receptors that bind TGFβ, the ALK1 and ALK5 receptors. Previous data from our research group suggest that TGFβ induces the expression of TSP1 in ECs through activation of the ALK5 receptor.The aim of this study was to investigate the interplay between TGFβ and TSP1 in endothelium, the roles of the ALK1 and ALK5 receptors and the effects on angiogenesis and breast cancer growth.Assessment of angiogenesis was carried out using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in vitro as well as an ex vivo model using mouse aorta. Breast cancer cell growth was assessed in vitro as well as comparing human histological samples from normal breast, cancerous breast and metastatic lymph nodes.HUVECs abundantly expressed TSP1 upon TGFβ stimulation. The expression of the protein ID1 was increased in HUVECs when TSP1 was knocked down. HUVECs with adenovirally induced expression of constitutively active (ca) ALK5 produced high amounts of TSP1 while TSP1 production in HUVECs with caALK1 was in line with that of non-infected HUVECs. Tube-like structure formation of HUVECs in culture was increased in the absence of TSP1. The tips of the sprouts of the tube-like formation showed high expression of ID1 but low expression of TSP1. Mouse aorta ring assay showed inhibition of angiogenic sprouting with induced expression of caALK5 while sprouting was abundant with caALK1. The proliferation of breast cancer cells (MCF7 and MDA-MB-231) was decreased when cultured with conditioned medium from stable HUVECs as well as when cultured in the presence of recombinant TSP1. In human histological samples from normal breast, primary tumors of the breast (localized and disseminated) and metastatic lymph nodes, both TSP1 and ID1 expression was seen in ECs and normal epithelial as well as tumor cells. No difference was seen in the expression between sample groups. The expression could not be connected to areas with increased or decreased cell divisions (reflected by Ki67 staining) nor to proximity to big or small vessels (chosen to represent stable or active endothelium, respectively). In conclusion, TGFβ induces expression of TSP1 in ECs through activation of the ALK5 receptor, leading to inhibition of angiogenesis and decrease in breast cancer cell proliferation in vitro. However, it was not possible to verify this in histological samples from human tissue.

Brjóstakrabbamein er algengasta krabbamein kvenna á heimsvísu og horfur sjúklinga versna til muna ef meinvörp greinast. Æxli reiða sig á æðakerfið til flutnings súrefnis og næringarefna með blóðinu en nýlega hafa komið fram gögn sem benda til þess að flæðisóháð áhrif æða hafi mikilvægt stjórnunarhlutverk í sameindafræðilegu umhverfi æxlisins. Æðaþelsfrumur mynda innsta lag æðanna í æðakerfinu og áhrif þeirra eru mikilvæg í æðamyndun sem og í sameindafræðilegu umhverfi æxla. Nýlegar rannsóknir benda til þess að dreifðar æxlisfrumur haldist í dvala ef þær eru nálægt stöðugu æðaþeli þar sem engin nýæðamyndun á sér stað. Við þessar aðstæður tjáir æðaþelið thrombospondin 1 (TSP1), sem er sykruprótein með þekkt hemjandi áhrif á æðamyndun. Hins vegar, á svæðum þar sem virk æðamyndun á sér stað, geta æxlisfrumur vaknað af dvalanum og farið að fjölga sér. TGFβ boðleiðin hefur áhrif bæði á nýæðamyndun og æxlisþróun. Æðaþelsfrumur hafa tvo mismunandi viðtaka sem geta bundist TGFβ, ALK1 og ALK5 viðtakana. Fyrri niðurstöður rannsóknahóps okkar benda til þess að TGFβ örvi tjáningu TSP1 í æðaþelsfrumum með virkjun á ALK5 viðtakanum.Markmið þessarar rannsóknar var að skoða samspilið milli TGFβ og TSP1 í æðaþeli, mismunandi hlutverk ALK1 og ALK5 viðtakanna og áhrifin á æðamyndun og brjóstakrabbameinsvöxt.Æðamyndun var metin með því að skoða æðaþelsfrumur úr naflastrengsbláæð manna (HUVECs) in vitro auk ex vivo líkans þar sem notuð var ósæð úr músum. Vöxtur brjóstakrabbameinsfrumna var metinn in vitro auk þess sem borin voru saman vefjasýni frá íslenskum konum úr heilbrigðum brjóstvef, krabbameinum í brjósti og eitlameinvörpum.HUVECs höfðu mikla TSP1 tjáningu við örvun með TGFβ. Tjáning próteinsins ID1 jókst í HUVECs þegar TSP1 var slegið niður. HUVECs sem voru yfirtjáðar með sívirkum (ca) ALK5 viðtaka ýttu undir mjög mikla TSP1 tjáningu en HUVECs með caALK1 höfðu TSP1 tjáningu samsvarandi því sem sást hjá ósýktum HUVECs. Pípulaga myndun HUVECs í rækt jókst þegar TSP1 var ekki til staðar. Sprotaendarnir í pípulaga mynduninni sýndu mikla ID1 tjáningu en litla TSP1 tjáningu. Prófanir á ósæðahringjum úr músum sýndu hindrun á æðasprotamyndun þegar framkölluð var tjáning á caALK5 á meðan sprotamyndun var mikil með caALK1. Brjóstakrabbameinsfrumur (MCF7 og MDA-MB-231) sýndu minni heildarfjölda frumna í rækt þegar þær voru ræktaðar í skilyrtu æti af stöðugum HUVECs og eins þegar þær voru ræktaðar með tilbúnu TSP1. Í vefjasýnum frá mönnum úr eðlilegum brjóstvef, frumæxlum í brjósti (staðbundnum og dreifðum) og eitlameinvörpum sást tjáning TSP1 og ID1 í æðaþelsfrumum og eðlilegum þekjufrumum sem og æxlisfrumum. Enginn munur sást á tjáningunni milli sýnahópa. Ekki var hægt að tengja tjáninguna við svæði með auknum eða minnkuðum fjölda frumuskiptinga (endurspeglað í Ki67 tjáningu) né heldur nálægð við stórar eða smáar æðar (valdar til að endurspegla stöðugt æðaþel annars vegar og virkjað æðaþel hins vegar, í þessari röð). Í stuttu máli eykur TGFβ tjáningu TSP1 í æðaþelsfrumum með virkjun á ALK5 viðtakanum en það leiðir til hindrunar á æðamyndun og hindrunar á fjölgun brjóstakrabbameinsfrumna in vitro. Hins vegar tókst ekki að staðfesta þessar niðurstöður í vefjasýnum úr íslenskum konum.