The epidemiology of Haemophilus influenzae in healthy carriers and infected in Iceland following the introduction of Protein D conjugated vaccine

Abstract

Introduction: Haemophilus influenzae is part of the normal flora of the nasopharynx but can cause a variety of infections, especially in young children and patients with underlying diseases. H. influenzae can express a polysaccharide capsule, six serotypes (a-f) have been identified. Strains without a capsule are called Non-Typeable H. influenzae (NTHi). Antibiotic resistance in H. influenzae has increased for the last decade, especially because of penicillin-binding protein 3 (PBP3) modifications. In 2011 a 10-valent conjugated pneumococcal vaccine (PHiD-CV) was introduced in Iceland, which uses protein D (PD) derived from NTHi as a conjugate. PD is encoded by the hpd gene and is in most H. influenzae. By using PD as a conjugate there is a possibility that the vaccine could provide protection against H. influenzae infections.Aims: The aims of this study were to continue to assess the effects of the vaccination on carriage rate of H. influenzae among healthy children, the prevalence of the hpd gene and each serotype of H. influenzae both in carriage isolates and in clinical samples. Furthermore, to assess the effects on the antimicrobial susceptibility pattern of H. influenzae.Material and methods: Nasopharyngeal samples were obtained from healthy children attending 15 DCCs in the Reykjavik capital area of Iceland (2009, 2012-2018). H. influenzae isolated from clinical samples from the middle ear (ME), lower respiratory tract (LRT) (2012-2018) and invasive infections (1996-2018) sent to the Department of Clinical Microbiology were also included in this study. PCR was used for H. influenzae identification with hpd primers, and fucK primers for hpd-negative isolates. bexA primers were used for capsule detection, then further serotyped with serotype specific primers. Disk diffusion and E-tests were used to test for antibiotic susceptibility. The screening test from The Nordic Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing was used for detection of β-lactam resistance mechanism(s), using benzylpenicillin unit 1 and cefaclor. Nitrocefin test was used to test for β-lactamase production. Selected isolates from selected years were whole genome sequenced.Results: A total of 4,070 nasopharyngeal samples were collected from which 2,812 H. influenzae isolates were identified (overall carriage rate 69.1%). hpd-negative isolates were 177 (6.3%) and a total of 34 isolates (1.2%) had a capsule, mostly serotype f. β-lactam resistance mechanism(s) was detected in 819 isolates (29.1%) where 524 (18.6%) had PBP3 modifications and 366 (13.0%) produced β-lactamase. Both mechanisms were detected in 71 isolates (2.5%). A total of 490 isolates (17.4%) were ampicillin resistant and 230 (8.2%) amoxicillin-clavulanate resistant. A total of 4,300 ME samples were collected from which 997 H. influenzae isolates were identified. The number of ME samples and H. influenzae positive ME samples decreased. hpd-negative isolates were 81 (8.1%) (increasing from 5.4-19.0%) and five (0.5%) had a capsule. Susceptibility results were available for 899 isolates. β-lactam resistance mechanism(s) was detected in 253 (28.1%) where 171 (19.0%) had PBP3 modifications and 142 (15.8%) produced β-lactamase. Both mechanisms were detected in 60 (6.7%) isolates. A total of 174 isolates (19.3%) were ampicillin/amoxicillin resistant and 18 (2.0%) amoxicillin-clavulanate resistant. A total of 14,591 LRT samples were collected from which 1,027 H. influenzae isolates were identified. The number of LRT samples increased but H. influenzae positive LRT samples decreased. hpd-negative isolates were 35 (3.4%) and two (0.2%) isolates had a capsule. Susceptibility results were available for 989 isolates. β-lactam resistance mechanism(s) was detected in 522 (52.8%). 415 (42.0%) had PBP3 modifications (increasing from 33.3-41.9% ). 200 (20.2%) produced β-lactamase. Both mechanisms were detected in 93 (9.4%) isolate (increasing from 4.6-14.0%). A total of 286 isolates (28.9%) were ampicillin/amoxicillin resistant and 71 (7.3%) amoxicillin-clavulanate resistant. A total of 73 H. influenzae isolates were identified from invasive infections. No isolate was hpd-negative and 11 (15.1%) had a capsule, mostly serotype f. β-lactam resistance mechanism(s) was detected in 29 isolates (39.7%) where 21 (28.8%) had PBP3 modifications and ten (13.7%) produced β-lactamase. Two (2.7%) had both mechanisms. 12 isolates (16.4%) were ampicillin/amoxicillin resistant and five (6.8%) amoxicillin-clavulanate resistant.Conclusion: 10-valent PHiD-CV vaccination did not decrease H. influenzae carriage rate in Iceland. The number of ME samples decreased but increased for LRT samples. The number of H. influenzae positive ME and LRT samples increased. hpd-negative isolates increased after vaccination in ME samples. Encapsulated isolates were the minority, serotype f the most common serotype. Isolates with PBP3 modifications and both mechanisms from LRT samples increased during the study period.

Inngangur: Haemophilus influenzae er hluti af eðlilegri örveruflóru í nefkoki. Bakterían getur þó valdið mörgum misalvarlegum sýkingum í mönnum, einkum í ungum börnum og sjúklingum með undirliggjandi sjúkdóma. H. influenzae getur haft hjúp og til eru sex hjúpgerðir (a-f). Hjúplausir stofnar kallast Non-Typeable H. influenzae (NTHi). Síðasta áratuginn hefur sýklalyfjaónæmi í H. influenzae farið ört vaxandi, miðlað á ýmsan máta en aðallega vegna breytinga í penicillin-bindi próteini 3 (PBP3). Árið 2011 hófst ungbarnabólusetning gegn pneumókokkum á Íslandi þar sem bólusett er með próteintengdu bóluefni gegn 10 hjúpgerðum pneumókokka, PHiD-CV. Burðarpróteinið er prótein D (PD), sem finnst í langflestum stofnum H. influenzae. hpd genið skráir fyrir PD. Með því að nota PD sem burðar prótein er möguleiki að bóluefnið getið einnig veitt vernd gegn H. influenzae sýkingum.Markmið: Markmið þessarar rannsóknar var áframhaldandi skoðun á áhrifum bólusetningar á berahlutfall, tíðni hpd-neikvæðra stofna ásamt tíðni hjúpgerða á Íslandi, bæði úr berasýnum og sýnum úr sjúklingum. Einnig að skoða áhrif bólusetningar á sýklalyfja næmismynstur H. influenzae stofna.Efni og aðferðir: Berasýni voru nefkokssýni safnað úr heilbrigðum börnum frá 15 leikskólum á höfuðborgarsvæðinu (2009, 2012-2019). Sjúklingasýni voru úr miðeyrum, neðri öndunarvegum (2012-2018) og ífarandi sýkingum (1996-2018) sem bárust á Sýkla- og veirufræðideild Landspítalans. Við greiningu á H. influenzae var multiplex PCR aðferð notuð með sértækum vísum fyrir hpd genið, fyrir hpd¬-neikvæða stofna voru sértækir vísar fyrir fucK genið notaðir. Hjúpaðir stofnar voru greindir með vísum fyrir bexA genið, og jákvæðir stofnar voru svo nánar hjúpgreindir með sértækum vísum fyrir hverja hjúpgerð. Næmispróf voru framkvæmd með lyfjaskífuprófi og E-testi. The Nordic Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing skimunarprófið var notað til að greina β-laktam ónæmisþætti, sem notar benzylpenicillin einingu 1 og cefaclor. Nitrocefin próf var notað til að greina β-laktamasa. Hluti stofnanna var heilraðgreindur.Niðurstöður: Alls voru tekin nefkoksýni frá 4.070 heilbrigðum börnum þar sem 2.812 H. influenzae stofnar voru einangraðir (heildarberatíðni 69,1%). Alls voru 177 stofnar (6,3%) hpd-neikvæðir (4,9-8,0% á milli ára) og 34 stofnar (1,2%) höfðu hjúp. Hjúpgerð f sú algengasta. β-laktam ónæmisþættir greindust í 819 stofnum (29,1%) þar sem 524 (18,6%) höfðu breytingar í PBP3 og 366 (13,0%) framleiddu β-laktamasa. Í 71 stofni (2,5%) greindust báðir þættirnir. Alls voru 490 stofnar (17,4%) ampicillin ónæmir og 230 (8,2%) amoxicillin-clavulanate ónæmir. Alls voru 4.300 miðeyrnasýni send til greiningar hjá Sýkla- og veirufræðideild Landspítalans þar sem 997 H. influenzae stofnar voru greindir. Sýnum frá ME fækkaði marktækt ásamt H. influenzae jákvæðum sýnum. Alls var 81 stofn (8,1%) hpd-neikvæður (jókst frá 5,4-19,0%) og fimm (0,5%) höfðu hjúp. Niðurstöður úr næmisprófum voru til staðar fyrir 899 stofna. β-laktam ónæmisþættir greindust í 253 stofnum (28,1%) þar sem 171 (19,0%) höfðu breytingar í PBP3 og 142 (15,8%) framleiddu β-laktamasa. Í 60 stofnum (6,7%) greindust báðir þættirnir. Alls voru 174 stofnar (19,3%) ampicillin/amoxicillin ónæmir og 18 (2,0%) amoxicillin-clavulanate ónæmir. Alls voru 14.591 sýni frá neðri öndunarvegum send til greiningar þar sem 1.027 H. influenzae stofnar voru greindir. Sýnum frá LRT fjölgaði marktækt en H. influenzae jákvæðum sýnum fækkaði marktækt. Alls voru 35 stofnar (3,4%) hpd-neikvæðir og tveir (0,2%) höfðu hjúp. Niðurstöður úr næmisprófum voru til staðar fyrir 989 stofna. β-laktam ónæmisþættir greindust í 522 stofnum (52,8%). 415 (42,0%) höfðu breytingar í PBP3 þar sem marktæk hækkun sást frá 43 (33,3%) árið 2012 í 57 (41,9%) árið 2018. 200 (20,2%) framleiddu β-laktamasa. Í 93 stofnum (9,4%) greindust báðir þættirnir, marktæk hækkun sást frá 3,9-14,0%. Alls voru 286 stofnar (28,9%) ampicillin/amoxicillin ónæmir og 71 (7,3%) amoxicillin-clavulanate ónæmir. Alls 73 H. influenzae stofnar voru einangraðir úr ífarandi sýkingum. Enginn stofn var hpd-neikvæður og 11 (15,1%) höfðu hjúp. Hjúpgerð f sú algengasta. β-laktam ónæmisþættir greindust í 29 stofnum (39,7%) þar sem 21 (28,8%) höfðu breytingar í PBP3 og tíu (13,7%) framleiddu β-laktamasa. Í tveim stofnunum (2,7%) greindust báðir þættirnir. Alls voru 12 stofnar (16.4%) ampicillin/amoxicillin ónæmir og fimm (6.8%) amoxicillin-clavulanate ónæmir.Ályktanir: 10-gild PHiD-CV bólusetning lækkaði ekki beratíðni H. influenzae á Íslandi. ME sýnum fækkaði en LRT sýnum fjölgaði. H. influenzae jákvæðum ME og LRT sýnum fækkaði eftir bólusetningu. Hlutfall hpd-neikvæðra stofna hækkaði eftir bólusetningu í ME sýnum. Hjúpaðir stofnar voru fáir þar sem hjúpgerð f var algengust. Hlutfall stofna með PBP3 breytingar og báða ónæmisþættina jókst með tímanum í LRT sýnum.